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《中国协和医科大学》 2009年
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中药单体对cTnT~(R141W)转基因扩张型心肌病小鼠模型的治疗作用及机理研究

赵海苹  
【摘要】: 第一部分人参皂甙Rb1对cTnTR141W转基因扩张型心肌病小鼠模型的治疗作用及机理研究 背景近年来心血管领域的一个研究热点是心血管重构的药物干预。已发现多种西药及中药有效成分,能够逆转高血压、心梗等导致的心脏重构,尤其是左心室肥大(left ventricular hypertrophy, LVH)的发生和发展。然而却缺乏能够有效逆转扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)的心脏扩张及心功能衰竭的药物。本文从对心血管疾病有较好疗效的中药单体中挑选出11种,利用本所遗传中心建立的cTnTR141W转基因DCM小鼠模型,筛选得到可改善DCM心脏功能及重构的药物两种,分别是Rb1(Ginsenoside-Rb1)和TMPP (Tetramethylpyrazine phosphate),我们从多个层次研究其药理作用并进行机制的研究。方法对2月龄的cTnTR141W阳性鼠进行心脏超声检测,计算左心室收缩期内径(leftventricular internal diameter at end-systole, LVIDs)的平均值和95%的可信区间。我们将95%的可信区间的上限作为心脏扩张的标准,排除部分表型不显著的cTnTR141W阳性鼠。其余的阳性鼠被随机分为模型组和人参皂甙Rb1治疗组(70 mg/kg/d)。用相同年龄的阴性鼠作为对照组。分组后每个月进行一次超声。连续给药7个月。在长期给药的过程中以及给药终点,观察各给药组与模型组心功能各项指标的变化。进行Kaplan-Meier生存分析。计算心重指数。HE染色和Masson染色观察心肌细胞变化及间质变化。透射电镜分析心肌超微结构。RT-PCR检测心肌粘附蛋白Cx40、Cx43、E-cad、N-cad、P-cad、itga8和itgb1bp3的表达。免疫荧光激光共聚焦观察心肌粘附分子Itga8的表达与分布。Western blot检测心脏HB-EGF, pSTAT3, STAT3表达水平。结果Rb1长期给药能显著改善该模型的心功能和心脏几何构型,将死亡率降低50%。Rb1治疗组心重指数降低11.3%(P0.05)。光镜观察显示Rb1能减轻心肌细胞排列紊乱以及间质纤维化。透射电镜观察显示Rb1能减轻心肌超微结构的破坏。RT-PCR结果显示,在模型中Cx40表达降低,E-cad、itga8和itgb1bp3表达升高,但在Rb1组中接近正常水平。免疫荧光激光共聚焦结果显示Rb1可降低Itga8的表达量并调节其分布。Western blot结果显示Rb1能够显著降低模型中的HB-EGF及pSTAT3的表达,但tSTAT3的表达在三组无显著差异。结论本研究显示,Rb1与TMPP可作为治疗遗传性DCM的候选药物。Rb1可改善扩张型心肌病模型的心功能,抑制心脏重构,其作用可能部分通过调节粘附蛋白的表达,抑制心肌病发生中的HB-EGF表达及抑制下游信号pSTAT3的激活实现的。 第二部分磷酸川芎嗪对cTnTR141W转基因扩张型心肌病小鼠模型的治疗作用及机理研究 目的利用cTnTR141W转基因扩张型心肌病小鼠模型,研究磷酸川芎嗪(TMPP)对遗传性扩张型心肌病心功能及重构的影响,并对其机制进行研究。 方法将cTnTR141W转基因阳性鼠随机分为模型组和TMPP组(45mg/kg/d),连续给药7个月,取同龄阴性鼠作为对照组。超声检测心脏功能及几何构型。用Kaplan-Meier法进行生存分析。计算心重指数。RT-PCR检测心肌肥厚标志基因的表达。HE染色和Masson染色观察心肌细胞变化及间质变化。透射电镜分析心肌超微结构。Western blot和免疫荧光激光共聚焦观察心肌肌小节蛋白Myotilin和MLC2的表达与分布。RT-PCR检测心肌钙相关信号CaM/CaMKⅡ通路的表达情况。 结果TMPP长期给药能显著改善该模型的心功能和构型,将死亡率降低54%。TMPP显著降低心重指数(P0.05),并降低心肌肥大标志基因ACTA1、BNP的表达,即减轻了扩心病小鼠的心肌肥厚。光镜观察显示TMPP能减轻心肌细胞排列紊乱以及间质纤维化。透射电镜观察显示Rbl能减轻心肌超微结构的破坏。Western blot及免疫荧光激光共聚焦结果显示,在模型组中,心肌肌小节Z-disc蛋白Myotilin表达升高,收缩蛋白MLC2磷酸化程度降低,给药处理后其表达接近正常水平。RT-PCR结果显示,在模型组中,心肌钙信号通路CaM/CaMKⅡ被激活,TMPP对该信号通路有抑制作用。 结论TMPP可改善扩张型心肌病模型的心功能,抑制心脏重构,其作用可能部分通过抑制钙激活信号通路包括CaM/CaMKⅡ通路而实现的。 第三部分心脏特异表达NOL3转基因小鼠的建立 目的建立心脏特异表达NOL3转基因小鼠,用于研究该基因在心肌病发病中的作用。 方法Western blot检测小鼠NOL3表达谱。构建αMHC-NOL3表达载体,显微注射法建立NOL3转基因小鼠。PCR鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型。 结果NOL3在1月龄野生型鼠心脏、脑、骨骼肌中的高表达,在心脏中的表达不随年龄而改变。通过转基因小鼠的筛选,得到了3个NOL3转基因品系,其中1个品系心脏NOL3蛋白表达量与野生型鼠相比明显增加。单转NOL3基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化。 结论成功建立了心脏特异表达NOL3转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R285.5

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