避免乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒核酸漏检的新型实时荧光PCR方法的研究及其内标的建立

【摘要】： 目的 建立避免乙型肝炎病毒核酸漏检的新型双重实时荧光PCR测定方法,最大限度的避免乙型肝炎病毒感染者的漏检；同时制备对人无生物传染性、稳定的、耐DNase和RNase的、防止假阴性结果的内标,使实验结果更加可靠。 方法 我们从美国Los Alamos国家实验室网站和NCBI网站上下载所有的HBV序列,采用序列比对软件DNAMAN进行分析,查找保守区域。然后针对保守区域设计引物和探针,初步建立实时荧光PCR检测体系。 我们按照引物探针设计的基本原则,针对HBV基因组的保守区域设计许多组备选的引物探针,将那些能互补的检测所有类型HBV的引物探针两两组合,对一些HBV阳性样本进行检测,看能否起到检测能力增强的作用,选出最佳的2组引物探针组合,初步建立双引物双探针检测体系。 根据前面筛选出的最佳探针序列在HBV基因组中的位置,采用重叠延伸PCR技术将原来的检测探针结合区突变为内标探针结合区。为了使内标更加稳定,我们根据lambda噬菌体的克隆步骤使用了lambda噬菌体gt11载体和EcoRI的限制性酶切位点,采用体外包装技术构建了耐DNase酶和RNase酶的噬菌体内标,然后通过棋盘法确定了内标噬菌体在双引物双探针检测体系中的最佳掺入量。 我们使用双引物双探针检测体系对不同浓度的HBV DNA国际标准品进行了检测,并采用上述构建的噬菌体作为内标进行假阴性质控,考察了所建立方法的检测下限和特异性。通过大量临床样本,比较了单引物单探针、双引物双探针以及国内一些商品试剂盒的检测能力和临床适用性。 结果 通过大量临床样本的筛选,最终建立了检测性能最好的双引物双探针检测体系。成功的使用Lambda噬菌体包装技术构建了耐DNase和RNase的、对人无生物传染危险性的噬菌体,经过棋盘法筛选后,采用1000copies/ml的噬菌体颗粒作为防止假阴性结果的内标。 本研究建立的双引物双探针体系的检测下限为29.5 IU/ml,检测特异性为100%,检测线性R=0.993。在对69份临床样本的检测中发现双引物双探针体系的检测能力与罗氏公司的COBAS AmpliPrep (CAP)/COBAS TaqMan (CTM) HBV检测结果一致,明显优于单引物单探针检测以及国产HBV荧光定量检测试剂盒(上海科华HBV荧光定量检测试剂盒)。 结论 本研究建立的双引物双探针检测HBV DNA实时荧光PCR方法的检测下限为29.5 IU/ml,特异性为100%,检测线性R=0.993。在对临床样本的检测中证明具有很好的临床适用性,并且成本要低于罗氏公司的实时荧光PCR检测试剂盒,适于大规模的推广以及在发展中国家中应用。 本研究采用的Lambda噬菌体包装系统可以作为构建armored DNA的较好平台。此方法制备的armored DNA具有稳定性好、DNase酶抗性以及对人无生物传染危险性等优点,可以作为内标对HBV DNA检测的全过程进行监测,防止假阴性结果的发生。 目的 建立避免丙型肝炎病毒核酸漏检的新型双重实时荧光RT-PCR检测方法,最大限度的避免丙型肝炎病毒感染者的漏检；同时制备无生物传染性、稳定的、耐DNase和RNase的、防止假阴性结果的内标,使实验结果更加可靠。 方法 为了能精确的显示HCV基因组的保守区域,我们从美国Los Alamos国家实验室网站和NCBI网站上下载所有的HCV序列,采用序列比对软件DNAMAN进行分析,查找保守区域。然后针对保守区域设计引物和探针,初步建立实时荧光RT-PCR检测体系。 我们按照引物探针设计的基本原则,针对HCV基因组的保守区域(5′UTR)设计许多组备选的引物探针,将那些能互补的检测所有HCV基因型和亚型的引物探针两两组合,通过对一些临床HCV阳性样本检测,看能否起到检测能力增强的作用,选出最佳的2组引物探针组合,初步建立双引物双探针检测体系。根据筛选出的最佳探针序列在HCV基因组中的位置,采用重叠延伸PCR技术构建重组质粒,利用MS2噬菌体蛋白质和基因组RNA相互作用的机制及噬菌体衣壳蛋白空间构象的特点进行噬菌体颗粒的包装,表达出内含HCV RNA的内标病毒样颗粒,并使用不同浓度的内标病毒样颗粒分别掺入到高、中、低浓度的HCV血清中进行扩增,确定内标病毒样颗粒在反应中的最佳浓度。 我们使用双引物双探针检测体系对不同浓度的HCV RNA 国际标准品进行了检测,并采用内标病毒样颗粒进行假阴性质控,考察了所建立方法的检测下限和特异性。通过大量临床样本,比较了单引物单探针、双引物双探针以及国内、国际一些商品试剂盒的检测能力和临床适用性。 结果 通过大量临床样本的筛选,最终建立了检测性能最好的双引物双探针检测体系。成功的使用1000copies/ml的病毒样颗粒作为防止假阴性结果的内标,建立的双引物双探针体系的检测下线为38.99 IU/ml,检测特异性为100%,检测线性R=0.998。在对深圳市血液中心的109份血清样本的检测中发现双引物双探针体系的检测结果与罗氏公司的COBAS AmpliPrep (CAP)/COBAS TaqMan (CTM)检测结果一致,明显优于两种国产HCV荧光定量检测试剂盒(上海科华HCV荧光定量检测试剂盒和杭州博日HCV荧光定量检测试剂盒)。 结论 本研究建立的双引物双探针检测HCV RNA实时荧光RT-PCR方法的检测下限为38.99 IU/ml,检测特异性为100%,检测线形R=0.998,并能检测出所有的HCV基因型。在对临床样本的检测中证明具有很好的临床适用性,并且双引物双探针检测体系的成本要低于罗氏公司的CAP/CTM试剂盒,更适于大规模的推广以及在发展中国家中应用。 本研究制备的armored RNA具有稳定性好、DNase酶抗性以及对人无生物传染危险性等优点,可以作为内标对HCV RNA检测的全过程进行监测,防止假阴性结果的发生,使检测结果更加可靠。