收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

避免乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒核酸漏检的新型实时荧光PCR方法的研究及其内标的建立

孟双  
【摘要】: 目的 建立避免乙型肝炎病毒核酸漏检的新型双重实时荧光PCR测定方法,最大限度的避免乙型肝炎病毒感染者的漏检;同时制备对人无生物传染性、稳定的、耐DNase和RNase的、防止假阴性结果的内标,使实验结果更加可靠。 方法 我们从美国Los Alamos国家实验室网站和NCBI网站上下载所有的HBV序列,采用序列比对软件DNAMAN进行分析,查找保守区域。然后针对保守区域设计引物和探针,初步建立实时荧光PCR检测体系。 我们按照引物探针设计的基本原则,针对HBV基因组的保守区域设计许多组备选的引物探针,将那些能互补的检测所有类型HBV的引物探针两两组合,对一些HBV阳性样本进行检测,看能否起到检测能力增强的作用,选出最佳的2组引物探针组合,初步建立双引物双探针检测体系。 根据前面筛选出的最佳探针序列在HBV基因组中的位置,采用重叠延伸PCR技术将原来的检测探针结合区突变为内标探针结合区。为了使内标更加稳定,我们根据lambda噬菌体的克隆步骤使用了lambda噬菌体gt11载体和EcoRI的限制性酶切位点,采用体外包装技术构建了耐DNase酶和RNase酶的噬菌体内标,然后通过棋盘法确定了内标噬菌体在双引物双探针检测体系中的最佳掺入量。 我们使用双引物双探针检测体系对不同浓度的HBV DNA国际标准品进行了检测,并采用上述构建的噬菌体作为内标进行假阴性质控,考察了所建立方法的检测下限和特异性。通过大量临床样本,比较了单引物单探针、双引物双探针以及国内一些商品试剂盒的检测能力和临床适用性。 结果 通过大量临床样本的筛选,最终建立了检测性能最好的双引物双探针检测体系。成功的使用Lambda噬菌体包装技术构建了耐DNase和RNase的、对人无生物传染危险性的噬菌体,经过棋盘法筛选后,采用1000copies/ml的噬菌体颗粒作为防止假阴性结果的内标。 本研究建立的双引物双探针体系的检测下限为29.5 IU/ml,检测特异性为100%,检测线性R=0.993。在对69份临床样本的检测中发现双引物双探针体系的检测能力与罗氏公司的COBAS AmpliPrep (CAP)/COBAS TaqMan (CTM) HBV检测结果一致,明显优于单引物单探针检测以及国产HBV荧光定量检测试剂盒(上海科华HBV荧光定量检测试剂盒)。 结论 本研究建立的双引物双探针检测HBV DNA实时荧光PCR方法的检测下限为29.5 IU/ml,特异性为100%,检测线性R=0.993。在对临床样本的检测中证明具有很好的临床适用性,并且成本要低于罗氏公司的实时荧光PCR检测试剂盒,适于大规模的推广以及在发展中国家中应用。 本研究采用的Lambda噬菌体包装系统可以作为构建armored DNA的较好平台。此方法制备的armored DNA具有稳定性好、DNase酶抗性以及对人无生物传染危险性等优点,可以作为内标对HBV DNA检测的全过程进行监测,防止假阴性结果的发生。 目的 建立避免丙型肝炎病毒核酸漏检的新型双重实时荧光RT-PCR检测方法,最大限度的避免丙型肝炎病毒感染者的漏检;同时制备无生物传染性、稳定的、耐DNase和RNase的、防止假阴性结果的内标,使实验结果更加可靠。 方法 为了能精确的显示HCV基因组的保守区域,我们从美国Los Alamos国家实验室网站和NCBI网站上下载所有的HCV序列,采用序列比对软件DNAMAN进行分析,查找保守区域。然后针对保守区域设计引物和探针,初步建立实时荧光RT-PCR检测体系。 我们按照引物探针设计的基本原则,针对HCV基因组的保守区域(5′UTR)设计许多组备选的引物探针,将那些能互补的检测所有HCV基因型和亚型的引物探针两两组合,通过对一些临床HCV阳性样本检测,看能否起到检测能力增强的作用,选出最佳的2组引物探针组合,初步建立双引物双探针检测体系。根据筛选出的最佳探针序列在HCV基因组中的位置,采用重叠延伸PCR技术构建重组质粒,利用MS2噬菌体蛋白质和基因组RNA相互作用的机制及噬菌体衣壳蛋白空间构象的特点进行噬菌体颗粒的包装,表达出内含HCV RNA的内标病毒样颗粒,并使用不同浓度的内标病毒样颗粒分别掺入到高、中、低浓度的HCV血清中进行扩增,确定内标病毒样颗粒在反应中的最佳浓度。 我们使用双引物双探针检测体系对不同浓度的HCV RNA 国际标准品进行了检测,并采用内标病毒样颗粒进行假阴性质控,考察了所建立方法的检测下限和特异性。通过大量临床样本,比较了单引物单探针、双引物双探针以及国内、国际一些商品试剂盒的检测能力和临床适用性。 结果 通过大量临床样本的筛选,最终建立了检测性能最好的双引物双探针检测体系。成功的使用1000copies/ml的病毒样颗粒作为防止假阴性结果的内标,建立的双引物双探针体系的检测下线为38.99 IU/ml,检测特异性为100%,检测线性R=0.998。在对深圳市血液中心的109份血清样本的检测中发现双引物双探针体系的检测结果与罗氏公司的COBAS AmpliPrep (CAP)/COBAS TaqMan (CTM)检测结果一致,明显优于两种国产HCV荧光定量检测试剂盒(上海科华HCV荧光定量检测试剂盒和杭州博日HCV荧光定量检测试剂盒)。 结论 本研究建立的双引物双探针检测HCV RNA实时荧光RT-PCR方法的检测下限为38.99 IU/ml,检测特异性为100%,检测线形R=0.998,并能检测出所有的HCV基因型。在对临床样本的检测中证明具有很好的临床适用性,并且双引物双探针检测体系的成本要低于罗氏公司的CAP/CTM试剂盒,更适于大规模的推广以及在发展中国家中应用。 本研究制备的armored RNA具有稳定性好、DNase酶抗性以及对人无生物传染危险性等优点,可以作为内标对HCV RNA检测的全过程进行监测,防止假阴性结果的发生,使检测结果更加可靠。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 许万宏,姚炳华,曾文前,李永培,李淑萍,宗改兰;用PCR技术检测喘息性疾病患儿肺炎支原体的研究[J];中国优生与遗传杂志;1998年05期
2 郑荣涛,邱勇,李中伟,杜文莉,侯建玲,周盛基;性病门诊就诊人群沙眼衣原体感染及相关危险因素研究[J];中国麻风皮肤病杂志;2002年04期
3 邓少丽,罗阳;荧光定量PCR技术及其在临床上的应用[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;2002年05期
4 和振坤;血清乙型肝炎病毒核酸定量与肝损伤及干扰素应答的关系[J];第三军医大学学报;2004年05期
5 唐浏英,邱海燕,李元凯,张伟,尚德秋,胡德育,张福利,刘冬立,李巧林,王进,李秋芬;多聚酶链反应用于布鲁氏菌病病人诊断的流行病学评价[J];中华流行病学杂志;1997年03期
6 刘明团,王树声,朱田风,韦一知;PCR系统制备地高辛标记的探针检测脊髓灰质炎病毒核酸[J];中华流行病学杂志;1997年03期
7 郭晋海,邵锡如;PCR检测HBV-DNA及其临床意义探讨[J];青海医学院学报;1997年01期
8 翁炳焕;PCR法检测血清胃癌相关抗原[J];陕西医学检验;1997年03期
9 曹孟德,秦东春,郭小兵,苏堤,王东升,苏天水,燕桂香;HLA-DR快速基因分型PCR-SSP方法的建立[J];河南医科大学学报;1999年01期
10 王宁霞,李扬秋,蒋光愉,徐以浩;PCR技术检测大肠肿瘤及肿瘤样病变中EB病毒DNA[J];广东医学;1999年03期
11 耿志华,祝扬,罗畅民,邓松华;用SRID法检测结核性胸水中活动性结核标记物的意义[J];疾病控制杂志;1999年02期
12 赵庆萱,董勇前,陈翠萍;普通Taq DNA聚合酶扩增幽门螺杆菌尿素酶基因长片段[J];微生物学免疫学进展;1999年02期
13 郭金虎,余多慰,赵清良,张晓琼,李华,单祥年;应用显微操作和PCR技术进行基因的染色体定位[J];动物学杂志;2000年04期
14 吴爱军,王红,俞守义;在多基因PCR中对dNTP与Mg~(2+)的浓度关系的研究[J];中国公共卫生;2001年02期
15 赵玉千,郝珊,付耀文,吴长利;膀胱癌多重耐药基因表达的研究[J];吉林大学学报(医学版);2002年01期
16 翁梁,刘丹,姚为民,盛君;PCR方法在水蛭素基因克隆方面的新应用[J];中国生化药物杂志;2002年02期
17 李军;PCR技术在中医药研究中的应用[J];现代中医药;2002年01期
18 霍满鹏,蒲阿利,高成英;延安市179例性传播疾病测试分析[J];延安大学学报(自然科学版);2002年01期
19 张宏伟,徐永俊,张丽霞,丁鹏,陈嵘;小鼠ScFv基因片段的构建[J];中国公共卫生;2003年05期
20 龙腾,王蔚,蔡庆,刘俊峰;PCR检测产毒性大肠杆菌及初步应用[J];第四军医大学吉林军医学院学报;1995年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 谭诗文;余波;冉懋韬;蔡一鸣;艾玉萍;王璇;张华;;牛源HBV套式PCR方法建立及其S靶基因同源性分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年
2 王平;王辉;许文兵;朱元珏;;肺组织结核分枝杆菌巢式PCR快速检测[A];中华医学会呼吸病学年会——2011(第十二次全国呼吸病学学术会议)论文汇编[C];2011年
3 回文广;赵廷昌;孙福在;张卉;王建荣;高孝强;田丽;;实时荧光定量PCR原理及其应用[A];中国植物病理学会第六届青年学术研讨会论文集——植物病理学研究进展(第五卷)[C];2003年
4 张太翔;凌宗帅;徐彪;梁成珠;朱来华;孙军;王洪兵;;实时荧光定量PCR检测猪流感病毒方法的建立[A];动物检疫学分会2010年学术年会论文集[C];2010年
5 吴驰;张红梅;詹能勇;邓永聪;单万水;余卫业;;荧光定量PCR技术在肺结核诊断中的临床应用研究[A];2010年中国防痨协会临床/基础专业学术大会汇编[C];2010年
6 周素娟;张铁军;何纳;;HCV的C/E1区PCR扩增方法的改进[A];华东地区第十次流行病学学术会议暨华东地区流行病学学术会议20周年庆典论文集[C];2010年
7 李青;钟青萍;王丽;;海产品中副溶血弧菌的PCR快速检测方法的建立[A];“食品加工与安全”学术研讨会暨2010年广东省食品学会年会论文集[C];2010年
8 陈信忠;任聪;龚艳清;王寿昆;;实时荧光定量PCR法检测对虾白斑综合征病毒[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会(第三卷)[C];2010年
9 潘康成;冯兴;崔恒敏;张亚兰;赵爽;;实时荧光定量PCR检测鸡口服枯草芽孢杆菌后肠道芽孢杆菌数量变化[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(下册)[C];2010年
10 孙秋影;卢长春;魏强;庞淑芬;;LightCycler 480实时荧光定量PCR仪在献血者血液筛查中的应用[A];中国输血协会第五届输血大会论文专集(摘要篇)[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孟双;避免乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒核酸漏检的新型实时荧光PCR方法的研究及其内标的建立[D];中国协和医科大学;2010年
2 张在平;荧光定量PCR检测禽白血病病毒与RNA干扰抑制J亚群禽白血病病毒复制的研究[D];内蒙古农业大学;2010年
3 渠柏艳;基于血液样品和微流控芯片技术的细胞分离、PCR扩增及DNA测序方法研究[D];东北大学;2009年
4 张丽;实时定量PCR检测儿童急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因[D];北京协和医学院;2011年
5 肖性龙;多重荧光PCR与液相芯片高通量病原体检测体系的建立与应用[D];华南理工大学;2010年
6 李泽松;缺失型α-地中海贫血基因诊断芯片及在分子流行病学研究中的应用[D];重庆大学;2008年
7 陈智勇;胰腺癌相关基因mucin4的初步研究[D];第二军医大学;2005年
8 王彦君;细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因微卫星多态性与炎症性肠病相关性研究[D];吉林大学;2008年
9 马孟根;猪源致病性沙门氏菌耐药基因PCR和基因芯片检测技术研究[D];四川大学;2005年
10 夏乾峰;二聚体突变引物定量PCR技术的研发及其临床应用[D];重庆医科大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王稳;利用RT-PCR验证基于小鼠外显子芯片发现的脑缺血相关基因表达的研究[D];西北农林科技大学;2010年
2 刘新军;表达布氏杆菌sodc基因的重组沙门氏菌的构建及不同种布氏杆菌鉴别PCR检测方法的建立[D];华中农业大学;2010年
3 郭世奎;实时荧光定量PCR技术对结直肠癌患者肠道微生态的研究[D];昆明医学院;2011年
4 金戈;博尔纳病病毒磷蛋白的原核表达和p24片段荧光定量PCR试剂盒的研制开发[D];重庆医科大学;2011年
5 刘志国;实时多重荧光PCR快速鉴别布鲁菌方法的建立[D];内蒙古农业大学;2010年
6 郑升博;猪链球菌多重PCR检测方法的建立及屠宰场样品感染率的调查研究[D];上海交通大学;2010年
7 刘宁;PCR扩增16srRNA基因以快速诊断败血症及分型细菌[D];南昌大学;2010年
8 陈晶晶;不同纳米材料对PCR优化作用的研究及机制探讨[D];东华大学;2011年
9 谭景尹;PCR—膜芯片~(?)技术检测结核杆菌耐药基因突变的应用研究[D];广西医科大学;2011年
10 王文娟;食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制与应用[D];山东农业大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 通文;Bio—Rad公司推出快速定量PCR反应液[N];中国医药报;2008年
2 通言;ABI实时定量PCR仪获准与rRT—PCR Flu Panel联用[N];中国医药报;2008年
3 郭伟立;实时、个体、高效[N];中国医药报;2011年
4 记者 瞿剑;猪是否“感冒”五小时见分晓[N];科技日报;2009年
5 《金周刊》记者 朱杰;罗氏为何青睐深圳匹基[N];中国经营报;2001年
6 记者 张平阳 杨斌鹄;快速检测甲流 西安批量生产关键设备[N];西安日报;2009年
7 《金周刊》记者 朱杰 新华社记者 王璐;记者调查广州达安造假内幕[N];中国经营报;2001年
8 季爱华;饲料中牛羊源性成分测定新法通过审定[N];中国食品报;2009年
9 实习生 姜靖;提速:从30分钟到3秒钟[N];科技日报;2007年
10 ;饲料中牛羊源性成分测定法标准通过审查[N];中国畜牧兽医报;2009年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978