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中波紫外线诱导皮肤成纤维细胞凋亡的机制研究

徐浩翔  
【摘要】: 背景: 紫外线是与人体皮肤密切相关的一种重要的环境因素,根据波长不同,紫外线可分为长波紫外线(UVA,320-400nm)、中波紫外线(UVB,280-320nm)和短波紫外线(UVC,200-280nm)。能够到达地球表面的紫外线仅包括UVA和UVB,与UVA相比,同等剂量的UVB对皮肤的损伤强度是UVA的1000倍左右。 成纤维细胞是真皮的主要组成细胞,经紫外线照射后,皮肤成纤维细胞的生长、分化和功能等方面会发生明显的改变。本课题组在前期工作中通过双向电泳结合质谱鉴定和免疫印迹技术发现,小剂量UVB照射会导致皮肤成纤维细胞特有的骨架蛋白波形蛋白(vimentin)含量增加。波形蛋白含有胱天蛋白酶-8和-3的酶切位点,在细胞凋亡过程中,当细胞中的波形蛋白被这类蛋白酶破坏以后,其降解产物能够促进细胞凋亡。目的: 在UVB引起的皮肤成纤维细胞凋亡过程中,影响波形蛋白的胱天蛋白酶-8和-3是否能够被UVB激活,与胱天蛋白酶-8相关的受体相互作用蛋白-1如何变化;成纤维细胞特有的细胞骨架波形蛋白是否被胱天蛋白酶破坏,并横向比较了另外两种普遍存在的细胞骨架蛋白即微管蛋白和肌动蛋白在凋亡过程中的变化,从而探讨UVB对皮肤成纤维细胞凋亡的机制。 方法: (1)体外培养人原代皮肤成纤维细胞并进行传代,用第3-6代细胞进行实验; (2)为了选择合适的UVB照射剂量和观测时间,先用噻唑蓝(MTT)比色法比较了不同剂量UVB对成纤维细胞活力的影响,然后对比了150mJ/cm2 UVB照射细胞后,在12h、24h、36h和48h四个时间点细胞活力的变化; (3)用Hoechst染色法对细胞核染色,比较150mJ/cm2 UVB照射成纤维细胞后,在上述时间点观察细胞核的形态变化并计算凋亡细胞的数量; (4)用荧光比色法检测照射了150mJ/cm2 UVB的成纤维细胞中,不同时间点的胱天蛋白酶-8和-3的活性变化; (5)用细胞荧光和Western Blot技术检测照射UVB诱导凋亡的成纤维细胞中波形蛋白的蛋白含量的变化; (6)用Western Blot技术检测照射了150mJ/cm2 UVB的成纤维细胞中,α-微管蛋白、β-微管蛋白和β-肌动蛋白的蛋白含量的变化; (7)用RT-PCR和Western Blot技术检测照射了150mJ/cm2 UVB的成纤维细胞中受体相互作用蛋白-1的mRNA和蛋白含量的变化。 结果: (1)50-300mJ/cm2 UVB照射后24小时,皮肤成纤维细胞的活力出现不同程度的下降;150mJ/cm2 UVB照射细胞以后,在12h、24h、36h和48h四个时间点,细胞活力逐渐降低; (2)150mJ/cm2UVB能够诱导皮肤成纤维细胞出现凋亡,当胱天蛋白酶的活性被抑制时,UVB诱导的凋亡细胞数量减少; (3) 150mJ/cm2UVB照射后,成纤维细胞的胱天蛋白酶-8和-3被激活,在照射后12h时,两者活性明显升高,随着时间的延长,其活性逐渐降低,在照射后48h时,其活性最低; (4)当抑制了胱天蛋白酶-8的激活时,胱天蛋白酶-3的活化延迟;反之,当胱天蛋白酶-3的活性被抑制时,胱天蛋白酶-8的活化也出现延迟; (5)当分别抑制胱天蛋白酶-8和-3的活性时,凋亡细胞的数量明显减少; (6)在UVB诱导皮肤成纤维细胞凋亡过程中,波形蛋白的含量增加,β-微管蛋白的含量减少,α-微管蛋白和β-肌动蛋白的含量不变; (7)在凋亡的成纤维细胞中,受体相互作用蛋白-1的mRNA含量减少,其蛋白含量升高。 结论: (1)在UVB诱导皮肤成纤维细胞凋亡过程中,活化的胱天蛋白酶-8和-3互相影响,共同发挥促进细胞凋亡的作用; (2)当细胞凋亡时,活化的胱天蛋白酶-8和-3不能通过水解其底物波形蛋白而影响细胞的凋亡; (3)在细胞凋亡过程中,细胞中减少的β-微管蛋白和升高的受体相互作用蛋白-1可能发挥着一定作用; (4)α-微管蛋白和β-肌动蛋白不受UVB的影响,在研究UVB诱导皮肤成纤维细胞凋亡时,它们可以作为免疫印迹的内参蛋白使用。


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