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RA诱导P19细胞神经分化中组蛋白去甲基酶Jmjd3对Mash1基因表达的调控作用

戴津泼  
【摘要】: 表观遗传学是指在基因的DNA序列不发生改变的情况下,基因的表达水平与功能发生改变,并产生可遗传的表型组,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、RNA介导的调控。组蛋白修饰是表观遗传学中很重要的调控方式。包括组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等,它对基因的激活和抑制起着重要作用。 Mashl是碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)家族的一个重要蛋白,在神经分化过程中起关键作用。我们以全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, atRA,简称RA)诱导小鼠胚胎瘤(embryonal carcinoma, EC) P19细胞作为神经分化的模型,探讨了表观遗传学特别是组蛋白修饰对神经分化关键基因Mash1的调控机制。 1.RA诱导P19细胞神经分化模型的建立 用0.5μM RA诱导培养P19细胞,细胞逐渐开始聚集成团状,4天后,将细胞重新置于正常培养基中培养,细胞出现类似神经元状的形态,细胞开始出现神经元分化的趋势。Western实验发现神经分化标志基因β-Tubulin在RA诱导后表达逐渐增加,表明RA诱导P19神经分化模型初步建立。 2.神经分化关键基因Mashl表达的检测 我们使用实时荧光定量PCR和1Western检测发现Mashl mRNA和蛋白在RA诱导2天后表达水平开始明显增加。免疫荧光实验发现,Mashl蛋白在RA诱导后表达增加。利用染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)的方法检测RNA聚合酶Ⅱ(RNAPolⅡ)在基因组中Mash1基因区域结合情况发现,RA诱导后RNAPolⅡ在Mash1启动子区结合增加,表明Mash1基因开始被激活。 3.RA诱导P19神经分化过程中Mash1基因启动子区核心组蛋白修饰变化 组蛋白共价修饰可动态调节染色质的结构,对基因转录具有重要的调控作用。核小体核心组蛋白N端尾部以及核心区的多个氨基酸残基可发生乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化、SUMO化、ADP核糖基化等翻译后修饰。这些修饰可以改变核小体中组蛋白与DNA或组蛋白与其他蛋白的相互作用,引起基因转录激活或关闭。 我们使用ChIP的方法检测了RA诱导后Mash1基因上游调控区以及编码区相应的组蛋白修饰状态变化。结果发现,在RA诱导后Mash1基因区域组蛋白H3K9和H3K14乙酰化水平逐渐上升,特别是在RA诱导第四天变化显著。组蛋白甲基化也是表观遗传的一个关键调控因素。组蛋白特异赖氨酸位点甲基化对于调控基因的转录有重要作用。ChIP结构显示:H3K9me3水平无明显变化;H3K4me3在诱导过程中逐步增加,在启动子近端区域和外显子区尤为明显;H3K27me3水平在诱导后逐渐降低,特别在第3天大幅下降;这些结果提示,组蛋白修饰在Mashl表达激活过程中发挥重要作用。 1.组蛋白赖氨酸H3K27去甲基化酶Jmjd3促进Mashl基因表达 组蛋白赖氨酸H3K27me3去甲基化酶Jmjd3在RA诱导后mRNA和蛋白表达水平增加。神经分化关键基因Mashl的H3K27me3修饰水平在RA诱导后明显下降。过表达Jmjd3能够促进Mashl表达增加,而抑制Jmjd3能使Mashl表达降低。同时,双荧光素酶实验证明Jmjd3能够促进Mashl启动子活性。利用ChIP技术,我们发现RA诱导后,Jmjd3在Mashl启动子上的结合增加。去甲基酶活性突变的Jmjd3不能促进Mashl表达和启动子活性。以上的结果证明,组蛋白赖氨酸去甲基化酶Jmjd3能够促进神经分化关键基因Mashl的表达并且这种作用依赖于其去甲基化酶的功能。


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