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《中国协和医科大学》 2010年
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系统性红斑狼疮MicroRNA表达谱和功能的初步研究

张立民  
【摘要】: 背景 MicroRNAs(miRNAs)属非编码RNA大家族,高度保守,广泛存在于从病毒、线虫、植物到动物体内,参与生物体的生长、发育、衰老、凋亡的调控。成熟miRNA通过核酸序列互补识别特定的目标mRNA,使之降解或抑制其翻译,从而抑制蛋白质的合成,达到调控基因表达的目的。生物信息学预测约1/3的mRNA受miRNA调控。在免疫细胞中表达的miRNA超过100个,在固有免疫及适应性免疫中发挥重要作用。近年来已经有研究显示在一些疾病中某些特定的miRNA与疾病的发生发展和预后密切相关,miRNA表达谱可以作为疾病的诊断和预后的指标。 系统性红斑狼疮(SLE)是最为经典的自身免疫病,其特征为多系统受累,体内多种自身抗体产生、免疫复合物沉积在多种组织器官引起的免疫病理损伤,但具体的发病机制仍不清楚。已经有许多研究证实T、B细胞的功能异常在SLE的发病机制中发挥着重要作用。鉴于miRNA在调节T、B等免疫细胞中起重要作用,因此我们推测1miRNA可能在SLE的发病中同样发挥着重要作用。外周血PBMC是研究miRNA在SLE免疫细胞作用很好的靶点,本研究从高通量筛选miRNA在SLE患者PBMC中表达差异入手,对miRNA在SLE发病机制中的作用进行了初步研究。 目的 本研究通过筛选SLE患者PBMC中miRNA表达谱差异,寻找与SLE发病相关的miRNA,分析miRNA相对表达量与SLE临床谱的相关性,初步探讨了miR-125b在SLE中的可能的作用机制。 方法 1 MicroRNA表达谱芯片技术检测847个成熟miRNAs在初治SLE和正常对照组间表达水平差异,应用分层聚类分析筛选并获得一批SLE特异性表达的1niRNA分子,采用Real-timePCR方法对芯片的结果进行验证。 2进一步扩大样本量,采用Real-timePCR方法对miR-125b在SLE患者、正常对照组及疾病对照组的表达水平进行检测,其中包括58例SLE患者、26例正常对照、8例类风湿关节炎(RA)患者、8例干燥综合征(pSS)患者,分析其与SLE临床谱的相关性;采用流式细胞仪分选免疫细胞,Real-timePCR方法检测miR-125b在不同免疫细胞中的相对表达量。 3应用生物信息学方法预测miR-125b的靶基因。构建靶基因表达载体,通过双荧光报告转染实验,体外运用荧光报告系统检测过表达miR-125b后对双荧光素酶报告基因活性的影响。 结果 1对847个成熟miRNAs的表达谱检测结果表明存在SLE特异性的miRNA表达谱。筛选并获得了一批SLE特异性表达的miRNA分子,其中有37个miRNA在SLE和正常人PBMC中表达差异显著,26个表达下调,11个表达上调,揭示了SLE患者PBMC中存在着特异的miRNA表达谱。进一步用Real-time PCR对上述结果进行了验证,得出相同结论。 2扩大样本量进一步证实了miR-125b在SLE患者外周血PBMC中表达量明显减低,与正常对照比较有明显差异,且降低幅度与SLE脏器受累相关。比较miR-125b在T、B细胞及非T、B细胞表达量中的差异发现miR-125b在T细胞表达差异最为明显。 3运用TargetScan等软件对miR-125b的靶基因进行了预测,根据软件评分及基因功能选择了Ets1、TNFAIP3和STAT3作为候选靶基因。构建了Ets1、TNFAIP3和STAT3的双荧光酶报告基因载体,体外实验证实miR-125b可与Ets1、TNFAIP3及STAT3相互作用,减弱报告基因的表达,推测Ets1、TNFAIP3和STAT3可能是1niR-125b的靶基因。 结论 该研究结果表明miRNA在SLE发病中发挥重要作用,miRNA表达信号谱可作为SLE诊断和病情评价重要生物标志物。1niR-125b通过作用于Etsl等靶基因影响T细胞功能参与SLE的致病机制,miR-125b可能成为SLE治疗新的药物干预靶点。
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R593.241

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