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《中国协和医科大学》 2010年
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sPLA_2-IIA对正常人单核诱导的巨噬细胞胆固醇外流的影响

窦丽阳  
【摘要】: 动脉粥样硬化过程是大血管及中血管的一种慢性炎症,大量研究表明,在心血管病患者血清中分泌型磷脂酶型A2的ⅡA亚型(sPLA2-ⅡA)水平会升高,而且升高的程度与疾病的严重程度相关。许多研究证实sPLA2-ⅡA不仅仅是动脉粥样硬化的危险因子和发生冠状动脉事件的预测因子,而且在动脉粥样硬化的发生和发展中起着一定的作用。目前关于sPLA2-ⅡA的抑制剂(Varespladib)已经进入Ⅱ期临床研究,但是sPLA2-ⅡA在促进动脉粥样硬化的发展进程中机制尚未完全清楚。胆固醇的逆转运是在动脉粥样硬化的发生的关键环节,其初始环节为胆固醇外流。本研究旨在探讨sPLA2-ⅡA对于胆固醇外流环节的影响。 1.探讨不同浓度sPLA2-ⅡA对正常人外周血单核巨噬细胞ABCA1、ABCG1、SRB1的mRNA及蛋白的表达情况的影响。 2.通过以HDL和ApoA1为接受体,研究不同浓度sPLA2-ⅡA干预后正常人单核巨噬细胞的胆固醇外流功能。 1.选取正常人外周血经过Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),贴壁法进行筛选,M-CSF刺激培养使单核细胞巨噬化。CD68免疫组化染色鉴定巨噬细胞。 2. Real-Time PCR方法检测不同浓度sPLA2-ⅡA对正常人单核巨噬细胞上干预24h后ABCA1、ABCG1、SRBⅠ的mRNA表达的影响。 3.Western Blot方法检测不同浓度sPLA2-ⅡA对正常人单核巨噬细胞干预24h的ABCA1、ABCG1、SRB1的蛋白表达。 4.H3胆固醇标记巨噬细胞,经过不同浓度sPLA2-ⅡA干预24h后分别以HDL为接受体,观察经ABCG1通路的胆固醇外流;以apoA1为接受体,观察经ABCA1通路的胆固醇外流。 5.统计分析:采用SPSS 13.0软件进行统计分析,计量资料以X±SD表示,组间比较以one-way ANOVA进行分析。 1.1)Real-Time PCR检测结果发现随着sPLA2-ⅡA浓度的增加,ABCA1mRNA表达呈下降趋势;当sPLA2-ⅡA为0.01μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml刺激巨噬细胞后ABCA1mRNA较空白对照组下降(P0.01),但3个浓度组间的ABCA1的表达无明显差别;1μg/ml的sPLA2-ⅡA对ABCA1表达抑制最为明显,相对于其他浓度组亦有明显的抑制作用(P0.01); 2)sPLA2-ⅡA浓度为0.01μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml时,对ABCG1mRNA呈抑制趋势,但未达到统计学差异;随着浓度增加,该差异逐渐明显,当sPLA2-ⅡA浓度为1μg/ml可明显抑制ABCG1的表达(p=0.033):3)sPLA2-ⅡA为0.5μg/ml及1μg/ml时对SRB1mRNA有着较明显的抑制作用,p值分别为0.011和0.007。 2.Western Blot检测结果发现经过各浓度sPLA2-ⅡA干预24小时ABCA1、ABCG1、SRB1的蛋白表达在各组之间无显著差异。 3.经过各浓度sPLA2-ⅡA干预24小时后由HDL和ApoA1介导的胆固醇外流率均有下降趋势,但尚未达到统计学差异(P0.05)。 1.经过sPLA2-ⅡA不同浓度干预正常人单核细胞衍生的巨噬细胞24小时,本研究的各干预浓度均对ABCA1的基因表达水平起抑制作用;sPLA2-ⅡA 1μg/ml时可影响ABCG1的基因表达下降;而SRB1基因水平在sPLA2-ⅡA 0.5μg/ml及1μg/ml亦受到抑制的作用。 2.本研究sPLA2-ⅡA2各浓度在干预正常人巨噬细胞24小时后并不改变ABCA1, ABCG1及SRB1的蛋白表达水平的改变。 3.随着sPLA2-ⅡA浓度逐渐升高,由ApoA1,HDL介导的正常人巨噬细胞胆固醇外流率有逐渐下降的趋势,但尚未达到统计学差异
【学位授予单位】:中国协和医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R543

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