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《首都医科大学》 2017年
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侯氏黑散及其代表性化学成分对脑缺血后神经血管单元损伤的保护作用及机制研究

常佳慧  
【摘要】:脑卒中是高发病率、高致残率及高死亡率的临床常见病,其中缺血性脑卒中占所有脑卒中发生的80-85%,属于中医学“中风病”范畴。神经血管单元是一个包括神经元、微血管和支持细胞在内的概念性结构。各组分间相互关联,共同维持大脑微环境的稳态平衡。侯氏黑散出自《金匮要略·中风历节病篇》,为医圣张仲景在《内经》基础上,基于对中风病因病机、辨证分类认识指导下,创立的治疗中风“第一方”。该方以风药配伍补虚药,“补气温阳固根本,风药入肝畅气血”,充分体现了“补不足,损有余”的立法思想。本课题从体内、体外两方面探讨侯氏黑散风药佐助补虚药对脑缺血后神经血管单元的保护作用及分子机制。目的1.通过神经功能评分,神经病理学形态观察评价侯氏黑散及拆方对大鼠脑缺血后神经血管单元损伤修复的影响;2.通过细胞培养、细胞形态学、细胞活性及相关分子生物学检测技术,探究侯氏黑散及拆方含药血清对氧糖剥夺损伤后神经血管单元中SY5Y细胞ERK/CREB通路及其下游凋亡相关的关键信号分子Bad、Bax、Bcl-2和Caspase-3的影响;3.通过分子生物学检测技术,探究方中绿原酸、木犀草苷、木犀草素及人参皂苷Rg1对脂多糖诱导BV2细胞过度活化后炎性介质NO、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β1分泌平衡的影响和炎症相关NF-κB信号通路的调控。方法1.采用大脑中动脉线栓法建立大鼠永久性中动脉栓塞模型;SD大鼠随机分为:假手术组、模型组、风药组、补虚药组、侯氏黑散组;Zea Longa 5级神经功能评分评价各组大鼠神经功能缺损程度;HE染色观察各组大鼠脑组织病理学形态改变;透射电镜观察各组大鼠神经血管单元、线粒体超微结构改变;2.Transwell共培养构建体外神经元、胶质细胞、血管内皮细胞共培养体系;缺氧缺糖培养4 h建立脑缺血后神经血管单元损伤模型;NVU共培养细胞随机分为:对照组、模型组、风药组、补虚药组、侯氏黑散组、风药+U0126组、补虚药+u0126组、侯氏黑散+u0126组、u0126组;光镜观察各组sy5y细胞形态;cck-8法检测各组sy5y细胞活性;细胞电压电阻表检测各组细胞跨内皮细胞电阻(teer);蛋白印迹法检测各组sy5y细胞erk、p-erk、creb、p-creb、bad、bax、bcl-2蛋白表达;荧光比色法检测各组sy5y细胞caspase-3活性;3.利用lps诱导bv2细胞过度活化,建立脑缺血后小胶质细胞炎症损伤模型;细胞随机分为对照组、模型组、绿原酸、木犀草苷、木犀草素、人参皂苷rg1处理组;光镜观察各组细胞形态;cck-8法检测各组细胞活性;griess法检测各组细胞上清中no含量;免疫酶联法检测各组细胞上清tnf-α、il-6、il-10、tgf-β1含量;蛋白印迹法检测各组细胞p-p65、p-iκbα蛋白表达。结果1.神经功能评分结果:与模型组相比,缺血3-7d侯氏黑散组大鼠神经功能评分显著降低(p0.05,p0.01);脑缺血4-5d,风药组、补虚药组大鼠神经功能评分较模型组均显著降低(p0.05);he染色结果:相较模型组,侯氏黑散及其拆方明显减轻脑缺血后脑组织病理学损伤。缺血坏死组织范围缩小,神经细胞数目增多,形态结构相对完整,血管管周间隙增大、炎细胞浸润及胶质细胞增生程度减轻,风药、补虚药、侯氏黑散组缺血脑区梗死灶周围皮层存活神经元细胞数明显增加(p0.05,p0.05,p0.001);电镜结果:相较模型组,侯氏黑散及其拆方明显减轻了脑缺血引起的超微结构损伤。神经元、血管、星形胶质细胞结构基本保持完整,水肿明显减轻,细胞核稍有固缩,空泡明显减少,线粒体形态结构基本完整,肿胀及空泡状改变减轻,内嵴数目和形态趋于正常,基质密度增高,高电子密度中毒颗粒和空泡减少;2.细胞形态观察:与正常组相比,模型组细胞肿胀变形,胞体轮廓模糊,折光性下降,胞浆内颗粒变性,细胞间连接疏松,间隙增大;teer检测结果:与模型组相比,各含药血清及含药血清+u0126组teer值明显增高(p0.05,p0.01,p0.001),与风药组相比,侯氏黑散组teer值显著增高(p0.05);细胞活性结果:与模型组相比,风药、补虚药、侯氏黑散及侯氏黑散+u0126组sy5y细胞活性明显增高(p0.01,p0.001,p0.001,p0.05),与风药组相比,补虚药组细胞活性显著增加(p0.01);蛋白检测结果:与模型组相比,风药、补虚药、侯氏黑散组p-erk蛋白表达明显增高(p0.05),与风药组相比,风药+u0126组p-erk蛋白表达明显降低(p0.05),与侯氏黑散组相比,侯氏黑散+u0126组p-erk蛋白表达明显降低(p0.01);与模型组相比,补虚药、侯氏黑散组p-creb蛋白表达明显增高(p0.001),与补虚药组相比,补虚药+u0126组p-creb蛋白表达明显降低(p0.001),与侯氏黑散组相比,侯氏黑散+u0126组p-creb蛋白表达明显降低(p0.001);与模型组相比,补虚药、侯氏黑散组bad蛋白表达明显降低(p0.01,p0.05),与补虚药组相比,补虚药+u0126组bad蛋白表达明显增高(p0.05),与侯氏黑散组相比,侯氏黑散+u0126组bad蛋白表达明显增高(p0.05);与模型组相比,补虚药、侯氏黑散组bax蛋白表达明显降低(p0.05,p0.01),与补虚药组相比,补虚药+u0126组bax蛋白表达明显增高(p0.01);与模型组相比,风药、补虚药、侯氏黑散、风药+u0126组bcl-2蛋白表达明显增高(p0.001,p0.01,p0.01,p0.05);与模型组相比,各含药血清及含药血清+u0126组caspase-3活性均明显降低(p0.001,p0.05),与风药组相比,侯氏黑散组caspase-3活性显著降低(p0.001),风药+u0126组caspase-3活性明显增高(p0.01);3.炎症因子检测结果:绿原酸、木犀草苷、木犀草素、人参皂苷rg1可显著降低bv2细胞细胞上清促炎因子no、tnf-α、il-6水平(p0.001),绿原酸、木犀草素、人参皂苷rg1可显著升高抑炎因子il-10水平(p0.001),人参皂苷rg1可显著升高抑炎因子tgf-β1水平(p0.001);蛋白检测结果:绿原酸、木犀草苷、木犀草素、人参皂苷rg1可显著降低细胞中p-p65蛋白表达(p0.01,p0.05,p0.05,p0.01),显著降低p-iκbα蛋白表达(p0.05,p0.05,p0.05,p0.01)。结论1.风药、补虚药、侯氏黑散均可减轻脑缺血后神经功能评分;减轻脑缺血后组织病理学形态改变,促进神经元存活;减轻神经元、血管、星形胶质细胞和线粒体超微结构损伤,改善脑缺血大鼠神经血管单元病理损伤,侯氏黑散全方效果最佳;2.风药、补虚药、侯氏黑散含药血清均可减轻氧糖剥夺损伤后神经血管单元共培养体系中SY5Y细胞损伤,其机制可与ERK/CREB信号通路及其下游凋亡相关分子Bcl-2、Bad、Bax、Caspase-3表达及活性的调控相关。其中全方效果最佳,风药对提高凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表达作用明显,补虚药除提高Bcl-2蛋白表达外,对降低促凋亡因子Bad、Bax蛋白表达作用明显;3.侯氏黑散化学成分中绿原酸、木犀草苷、木犀草素、人参皂苷Rg1可从促炎、抑炎两方面调节炎症因子NO、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β1分泌,减轻脂多糖诱导BV2细胞过度活化,其机制与NF-κB通路活化的调节。
【学位授予单位】:首都医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R284;R285.5

【参考文献】
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