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《首都医科大学》 2017年
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补肾益髓方及其拆方对多发性硬化模型小鼠轴突损伤修复和神经营养信号的作用

师一民  
【摘要】:目的多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是中枢神经系统(central nervous system,CNS)炎性脱髓鞘的自身免疫性疾病。前期研究表明,具有补肾化痰活血作用的补肾益髓方能减缓MS的小鼠模型实验性自身免疫反应性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的轴突损伤,并促进其再生修复,但其作用机制还不明确。因此,在前期研究的基础上,结合目前国内外有关轴突再生机制及信号转导领域的研究,应用免疫组化、实时荧光定量PCR(quantitative RT-PCR,qRT-PCR)、蛋白质印迹法(western blot,WB)等技术,以轴突再生神经营养因子为研究重点,探讨补肾益髓方及其拆方对EAE小鼠轴突损伤和修复的作用及分子机制,以揭示中医补肾化痰活血法的现代内涵,为中医药辨证论治MS及相关疑难重症提供科学依据。方法140只C57BL/6雌性小鼠,随机分为正常对照(normal control,NC)、模型(model,MO)、醋酸泼尼松(prednisone acetate,PA,5mg/kg)、梓醇(catapol,CA,40mg/kg)、补肾益髓方(BSYS,3.02g生药/kg)、补肾方(BS,1.44g生药/kg)、化痰活血方(HTHX,1.57g生药/kg)组,每组20只。用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)35-55免疫小鼠制备EAE模型。各治疗组予相应药物灌胃,NC和模型组灌服生理盐水,每日1次,共40天。每日记录小鼠体重和神经功能评分,统计小鼠发病率和死亡率。在EAE小鼠发病第20天(急性期)和第40天(缓解期)取脑和脊髓。苏木素伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)观察其病理变化;透射电镜观察轴突和髓鞘变化;免疫组化法(immunohistochemistry,IHC)检测P-tau与beta-tubulin的表达;应用qRT-PCR、WB法测定BDNF/TrkB/PI3K/AKT mRNA及蛋白的表达。结果1补肾益髓方及其拆方补肾方和化痰活血方对EAE小鼠神经保护的作用1.1补肾益髓方及其拆方对EAE小鼠发病情况的影响造模前各组小鼠体重无统计学差异(P0.05)。造模后各小鼠体重缓慢上升,于第11天开始,与正常组比较,其他各造模组小鼠体重开始出现明显下降(P0.05)。于第19天降至最低,后缓慢回升。但第19天到第40天各造模组动物体重均较正常组显著降低(P0.01)。在第23天到40天,补肾益髓方和补肾组小鼠体重与激素组比较,回升明显(P0.05或P0.01)。1.2补肾益髓方及其拆方对EAE小鼠病理改变的影响模型组脑白质血管周围有炎细胞浸润,核固缩明显。激素、梓醇、补肾、化痰活血和补肾一岁组脑白质血管周围有炎细胞浸润,部分核固缩。病理程度较模型组低。脊髓病理变化与脑相似。1.3补肾益髓方及其拆方对EAE小鼠轴突损伤及修复的影响各组小鼠发病第20天和第40天,模型组中p-Tau表达明显上调,beta-tubulin表达明显下调,补肾益髓、补肾和化痰活血方均可明显下调p-Tau表达(P0.05,P0.01),上调beta-tubulin蛋白表达(P0.05,P0.01)。2 BSYS及其拆方对EAE小鼠轴突修复的作用机制研究综合qRT-PCR、WB检测结果发现,发病第20天和40天,补肾益髓方及其拆方补肾方与化痰活血方均可明显上调EAE小鼠脑和脊髓BDNF、TrkB、PI3K与AKT mRNA的表达,与模型组相比,均有统计学差异(P0.05)。补肾益髓方对上述各指标的作用趋势优于拆方补肾与化痰活血方,但无明显统计学意义(P0.05)。结论补肾益髓方及其拆方补肾方与化痰活血方均对EAE小鼠有神经保护作用,表现在减少体重丢失,降低神经功能评分,减轻炎性细胞浸润,减轻轴突损伤及促进其修复,尤以补肾益髓全方更为显著。其作用机制可能与与增强BDNF/TrkB及其信号通路PI3K/AKT表达有关。补肾方的作用与补肾益髓方作用相似,但化痰活血方作用不及前二者。这些结果为补肾益髓方治疗MS提供了部分科学依据。
【学位授予单位】:首都医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285.5;R-332

【参考文献】
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