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《首都医科大学》 2017年
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基于FGF2-DLK1信号通路研究一贯煎促进骨髓MSCs逆转肝纤维化的作用机制

乔天阳  
【摘要】:【目的】本研究使用中国传统方剂“一贯煎”,以骨髓MSCs可以抑制肝星状细胞活化的角度为切入点,观察肝纤维化大鼠肝组织中FGF2-Dlk1信号通路及其关键蛋白因子的改变,结合向肝组织中转移的骨髓MSCs的荧光示踪,从组织、细胞、基因层次论证一贯煎促进骨髓MSCs逆转肝纤维化的关键作用环节,为临床防治肝纤维化提供科学实验依据。【方法】建立肝纤维化模型大鼠。SD大鼠,雄性,54只,采用随机方式,分为正常组、模型组、一贯煎组、骨髓MSCs组、一贯煎加骨髓MSCs组、阳性组,每组9只。除正常组外,均建立肝纤维化恢复模型,分离、培养和标记骨髓MSCs,在CCl4停止注射3天后,骨髓MSCs组每只大鼠经尾静脉注射5×106mmol/L浓度1mol骨髓MSCs,一贯煎加骨髓MSCs组每只大鼠经尾静脉等量的骨髓MSCs外,给予一贯煎浓缩液1ml/100g灌胃,每天1次。一贯煎组予等量一贯煎浓缩液灌胃,每天1次。阳性组给予秋水仙碱灌胃,0.25mg/kg,每天一次,正常组和模型组按相同方法灌服等量生理盐水,连续4周。HE染色判定肝脏炎症活动度和纤维化程度。另取骨髓MSCs组和一贯煎加骨髓MSCs组同一部位肝叶,用于观察骨髓MSCs荧光示踪。其余肝组织用于WB检测col1、DLK1和Notch1的蛋白表达;RT-PCR检测col1、col3和DLK1 m RNA;ELLSA检测FGF2的蛋白表达。【结果】1.大鼠一般情况:与正常组相比,模型组大鼠精神、食水、毛发色泽以及活动度等均有不同程度的改变。与模型组大鼠对比,余下组别肝纤维化大鼠的一般情况状态均有不同程度的好转和改善。2.大鼠肝组织炎症活动度和纤维化程度检测:与正常组相比较,模型组肝组织炎症活动度、纤维化程度变化差异明显,有统计学意义(P0.05),提示肝纤维化大鼠模型造模成功。一贯煎组,骨髓MSCs组与模型组相比较纤维化程度有所降低,一贯煎加骨MSCs组与模型组相比较肝纤维化程度明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。提示一贯煎及骨髓MSCs均能改善肝纤化大鼠肝组织的炎症程度和纤维化程度,而二者相互配合改善效果最为明显。3.大鼠阴虚证指标检测:体重:一贯煎组、骨髓MSCs组、一贯煎加骨髓MSCs组和阳性组体重增长速度均明显高于模型组(P0.05);舌面干湿度:一贯煎加骨髓MSCs组大鼠的舌液分泌重量较模型组增高(P0.05);舌面温度:模型组舌面温度同正常组相比较明显增高(P0.05);骨髓间MSCs组与模型组相比较有所降低,但无统计学差异;一贯煎加骨髓MSCs组与模型组相比较明显降低(P0.05);舌血流速度:一贯煎组舌血流速度较阳性对照组及模型组明显降低(P0.05);一贯煎加骨髓MSCs组舌血流速度与模型组相比较降低更为明显(P0.05);饮水量:模型组大鼠饮水量与正常组相比较无明显差异;一贯煎加骨髓MSCs组大鼠饮水量与模型组相比较明显降低(P0.05)。4.大鼠肝组织胶原面积检测:模型组大鼠肝组织中的胶原面积水平与正常组相比差异明显(P0.05)。提示,肝纤维化大鼠模型建立成功。与模型组比较,阳性对照组、一贯煎组,骨髓MSCs组和一贯煎加MSCs组肝组织中的胶原面积显著降低(P0.05)。提示,一贯煎能够有效降低肝纤维化大鼠肝组织中的胶原面积,从而改善纤维化程度。5.一贯煎向大鼠肝组织转移骨髓MSCs的检测:一贯煎加骨髓MSCs组结果显示其骨髓MSCs荧光面积明显多于骨髓MSCs组(P0.05),说明一贯煎对骨髓MSCs向肝脏组织转移有促进作用。6.大鼠肝组织中col1、DLK1和Notch1的蛋白表达:与正常组比较,模型组肝组织中col1、DLk1、Notch1的表达显著增高(P0.05)。与模型组比较,骨髓MSCs组、一贯煎加骨髓MSCs组和一贯煎组肝组织中的col1、DLk1、Notch1的表达显著减少(P0.05)。7.大鼠肝组织中的col1、col3和DLK1 m RNA的表达:模型组大鼠肝组织中col1、col3和DLK1 m RNA的表达量与正常组比较明显升高(P0.05)。与模型组比较,骨髓MSCs组、一贯煎加骨髓MSCs组和一贯煎组的col1、col3和DLK1 m RNA的表达降低明显(P0.05)。8.大鼠肝组织中FGF2的蛋白表达:与正常组相比,模型组肝组织FGF2表达有所增高。与模型组比较,一贯煎加骨髓MSCs组肝组织FGF2表达大幅度提升(P0.05)。【结论】滋补肝肾方药一贯煎可以有效促进骨髓MSCs向肝组织转移,改善肝纤维化模型的肝功能和阴虚证表征,有逆转其发展进程的作用。其作用机制可能与FGF2-DLK1信号通路的关键基因的表达有关,可提高FGF2蛋白的表达含量,从而降低DLK1等基因的表达,从而达到逆转肝纤维化的作用。对于临床应用一贯煎治疗肝纤维有一定的积极意义。
【学位授予单位】:首都医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285.5

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