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基于内皮祖细胞和脱细胞动脉基质构建组织工程静脉的研究

吴英锋  
【摘要】: 背景:组织工程概念产生于上世纪八十年代,具有巨大的应用潜力。目前对组织工程血管的研究尚处于临床前阶段,并主要局限在组织工程动脉方面,组织工程静脉方面的报道尚少。 目的:探索基于自体(犬)骨髓源血管内皮祖细胞(EPCs)和异种(猪)脱细胞动脉基质体外构建组织工程静脉的方法并初步评价其植入体内的可行性。方法: (1)使用条件培养基和纤维连接蛋白(Fn)衬底培养骨髓单个核细胞,相差显微镜观察形态变化,测量生长曲线观察增殖能力,不同时间点行VEGFR-2、CD133和Ⅷ因子的免疫细胞化学检测以定性并行CD34、VEGFR-2及CD133的流式细胞仪检测观察扩增效率,透射电镜(TEM)观察超微结构,检测其摄取乙酰低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)的功能。 (2)应用0.1%胰蛋白酶-0.01%EDTA于37℃震荡条件下脱除猪主动脉细胞成分,组织学切片、扫描电镜(SEM)和TEM观察脱细胞效果;比较脱细胞前后动脉的厚度、应力-应变曲线、极限抗张强度和断裂伸长率变化;犬皮下埋置1、3和6周,观察异种移植的免疫原性;种植成体犬颈外静脉内皮细胞观察细胞相容性。 (3)应用SEM和组织学方法,比较无预衬和预衬明胶、Fn对细胞铺植脱细胞动脉基质的影响;比较不同转速时铺植管状脱细胞基质的效果;比较静态和动态铺植的效果;比较单次和多次铺植的效果。观察铺植细胞摄取Dil-ac-LDL和抗血小板粘附功能。 (4)在前述结果基础上,PKH26-GL标记实验犬(n=8)EPCs后体外构建组织工程静脉,将其置换自体犬下腔静脉(约4cm长)并行单侧股动静脉转流术,以未种植细胞的猪脱细胞管状基质作为对照(n=4),术后10天、4周、12周造影后取材,行大体形态、SEM、TEM、组织学观察及标记细胞的PKH26-GL和Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测。 结果: (1)集落样生长的贴壁细胞平均10天单层汇合,外观鹅卵石样,能够摄取Dil-ac-LDL,VEGFR-2、CD133和Ⅷ因子免疫细胞化学染色均呈阳性,每毫升骨髓可获得约(1.3±0.3)×106个细胞,流式细胞术示VEGFR-2和CD133双阳性细胞在第10天扩增了242倍。 (2) HE染色、TEM和Pollak染色显示0.1%胰蛋白酶-0.01%EDTA处理96小时可脱除新鲜猪主动脉细胞成分同时基质的完整性不受破坏。脱细胞前后厚度、应力-应变曲线、极限抗张强度和断裂伸长率无统计学差异。皮下埋植1周时周缘有轻度炎细胞浸润,埋植6周时成纤维细胞浸润为主且基质内有毛细血管新生。内皮细胞可在基质腔面粘附伸展并形成有一定方向排列的单细胞层。 (3) Fn预衬、一次法2.5转/小时的动态铺植方法取得了较好的铺植效果。细胞覆盖率平均为84.4%±6.2%(n=12)。管状铺植的细胞能够摄取Dil-ac-LDL并具有抗小板粘附功能。 (4)应用本方法体外构建组织工程静脉血管,平均需时12天。实验(对照)组在第10天、4周和12周的通畅率分别为7/7(2/4)、6/6(2/2)和4/4(1/2)。植入12周时,Ⅷ因子相关抗原和α-actin免疫组织化学、SEM和TEM检测显示实验组植入血管全长覆盖紧密汇合的内皮细胞,植入血管中层有成纤维细胞和α-actin阳性细胞出现,通畅的对照移植物管腔面由纤维素形成的假内膜覆盖。免疫荧光显示铺植的细胞部分在原位存活,亦有新形成的内皮细胞。实验组植入血管有一定程度的缩窄。 结论: (1)离体扩增培养法可成功地扩增骨髓源EPCs,培养10天获取的细胞数量能够满足构建组织工程血管的需要。 (2)应用胰蛋白酶-EDTA制备的猪主动脉脱细胞基质,在生物力学、免疫原性和细胞相容性方面可以满足组织工程血管构建对支架的要求。 (3) Fn预衬管状脱细胞基质,2.5转/小时一次法动态铺植EPCs可取得84.4%±6.2%的内皮覆盖率,而且铺植细胞具有相应的生理功能。 (4)基于自体骨髓源EPCs和异种管状脱细胞动脉基质构建组织工程静脉是可行的,但需要改进基质并且增大样本量作长期观察。


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