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《北京中医药大学》 2010年
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野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡线粒体通路的研究

于蕾  
【摘要】:野西瓜(Capparis spinosa L)为山柑科山柑属植物,又称刺山柑、老鼠瓜、槌果藤等,味辛苦,性温,具有祛风除湿、止瘀消肿、止痛活血之功效。文献报道和前期实验显示,野西瓜具有抗肿瘤作用,且其活性成分为其生物碱类成分。本文对野西瓜生物碱的抗肿瘤活性组分进行了筛选,找出其敏感肿瘤细胞株为人胃癌细胞株SGC-7901,得到具有较强抑制肿瘤细胞增殖的组分——野西瓜极性生物碱A10组分,并应用HPLC法和UV法测定其含量。在此基础上,研究了野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞的细胞毒作用,通过MTT实验、SRB实验和集落形成率实验发现野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901具有生长抑制作用;然后利用凋亡形态学方法即荧光显微镜法和投射电镜法对SGC-7901凋亡形态进行定性研究;经PI单染法和AnnexinV-FITC/PI双染法,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜测定了野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞凋亡率和周期的影响;然后对野西瓜极性生物碱A10组分所诱导SGC-7901细胞凋亡线粒体通路的关键事件进行研究,包括MPTP孔开放程度、膜电位丧失、Cyt-c释放、Caspase-9及Caspase-3激活;在确定了其凋亡的线粒体途径后,又对线粒体凋亡调控因子如活性氧水平、Ca2+浓度进行检测,判断ROS积聚和钙超载是否参与野西瓜极性生物碱A10组分所诱导线粒体凋亡通路的调控。最后,对线粒体凋亡通路调控基因Bcl-2和Bax在蛋白表达水平和mRNA基因转录水平上分别利用Vestern Blot法、流式细胞术和RT-PCR法进行检测,以期揭示野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡的线粒体通路。 1野西瓜生物碱抗肿瘤活性组分的研究 1.1野西瓜总生物碱含量测定的研究 目的:测定野西瓜中盐酸水苏碱含量和总生物碱的含量。方法:HPLC方法和UV方法。结果:应用HPLC测定野西瓜中盐酸水苏碱的含量,得到盐酸水苏碱线性回归方程为Y=100.58X-9.3751(r=0.9999),说明其在1.5-30μg范围内呈良好线性关系,测得野西瓜中盐酸水苏碱的含量为8.2257 mg·g-’。同时以雷氏铵盐剩余比色法测定野西瓜中总生物碱(以盐酸水苏碱计)的含量,得到盐酸水苏碱线性回归方程分别为Y=0.621 7X+0.0108(r=0.9986),说明在其0.060-0.301 mg·mL-1范围内线性关系良好,测得野西瓜总生物碱含量(以盐酸水苏碱计)为104.7749 mg·g-1。通过方法学考察证实两个含量测定方法准确可靠。结论:HPLC法测得盐酸水苏碱的含量为8.2257 mg·g-1,雷氏铵盐剩余比色法(以盐酸水苏碱计)测定野西瓜中总生物碱的含量为104.7749 mg·g-1。 1.2野西瓜生物碱不同极性部位抗肿瘤活性的研究 目的:寻找野西瓜抗肿瘤的活性部位。方法:采用渗漉法对野西瓜果实进行初提取,然后将渗漉液通过阳离子交换树脂,待树脂床饱和后,对树脂进行碱化,干燥,再进一步对树脂床进行溶剂分级萃取。萃取顺序为氯仿、正丁醇、70%乙醇萃取,得到三个部位氯仿层、正丁醇层和70%乙醇层。采用MTT法对三个部位进行活性筛选。结果:野西瓜生物碱的70%乙醇极性部位有明显的抗肿瘤作用,IC50为33.437μg·mL-1,为野西瓜生物碱抑制SGC-7901细胞的活性部位。野西瓜生物碱的氯仿萃取部位、正丁醇萃取部位对SGC-7901细胞也具有一定的抑制作用,但作用不如70%乙醇极性部位部位明显。因此野西瓜生物碱的70%乙醇极性部位初步确定为野西瓜生物碱抑制SGC-7901细胞的抗肿瘤活性部位。结论:人胃癌SGC-7901细胞是野西瓜总生物碱的敏感细胞株,野西瓜生物碱70%乙醇层是其抗肿瘤的活性部位。 1.3野西瓜生物碱活性部位不同组分抗肿瘤活性的研究 目的:对野西瓜生物碱抗肿瘤活性部位——70%乙醇极性部位进行进一步分离,继续采用MTT方法进行活性组分的追踪。方法:柱层析和MTT法。结果:采用硅胶柱对野西瓜生物碱抗肿瘤活性部位——70%乙醇部位进行进一步的分离,用氯仿-甲醇梯度洗脱,TCL跟踪合并,得到A1~A12共12个组分,经改良碘化铋钾显色实验证实A1-A5、A11和A12组分中不含有生物碱成分,而A6~A10组分含有生物碱成分。经MTT实验筛选A6~A10组分的抗肿瘤活性。结果显示,A6~A10组分对SGC-7901细胞增殖均具有一定的抑制作用,其中A10组分的抑制作用最强,IC50为31.529μg·mL-1。称之为野西瓜极性生物碱A10组分。结论:A10组分是野西瓜生物碱抗肿瘤活性组分,称之为野西瓜极性生物碱A10组分。 目的:测定野西瓜极性生物碱A10组分的含量。方法:HPLC法和UV法。 结果:应用HPLC测定野西瓜极性生物碱A10组分中盐酸水苏碱含量,得到盐酸水苏碱线性回归方程为Y=1004.2X-5.3806(r=0.9999),结果表明:盐酸水苏碱在3-30μg范围内呈良好线性关系。测得野西瓜极性生物碱A10组分中盐酸水苏碱含量为367.7296 mg·g-1,方法学考察证明该含量测定方法准确可靠。采用本部分实验一所述UV法测得野西瓜极性生物碱A10组分中生物碱含量(以盐酸水苏碱计)为784.2096 mg·g-1。结论:HPLC法测得野西瓜极性生物碱A10组分中盐酸水苏碱含量为367.7296 mg·g-1。UV法测得野西瓜极性生物碱A10组分中生物碱含量(以盐酸水苏碱计)为784.2096 mg·g-1。 2野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞的生长抑制和诱导凋亡作用 2.1野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞生长的抑制作用 目的:对野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞生长的抑制作用进行研究。方法:MTT法、SRB法和肿瘤细胞克隆原形成法。结果:MTT实验得出野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞IC50为31.529μg·mL-1。从SRB实验结果可以看出,低浓度的野西瓜极性生物碱A10组分通过抑制细胞生长而起到抗肿瘤作用,而高浓度时则主要通过杀死肿瘤细胞起到抗肿瘤作用,经计算GI50为31.785μg·mL-1,LC50为37.210μg·mL-1,TGI为45.864 gg·mL-1。肿瘤细胞克隆原实验结果显示,野西瓜极性生物碱A10组分可以剂量依赖性抑制SGC-7901细胞集落的形成,其IC50为37.47μg·mL-1。结论:三个实验结果基本一致,更加客观的说明野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞具有生长抑制作用。根据以上结果,选择野西瓜极性生物碱A10组分为后续药理实验的受试药,且低、中、高剂量分别为15、30、60μg·mL-1。 2.2野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞凋亡的影响 目的:观察野西瓜极性生物碱A10组分作用后SGC-7901细胞形态学的改变和细胞凋亡率的测定。方法:荧光显微镜观察法、透射电镜观察法、激光共聚焦显微镜、PI单染法和Annexin V-FITC/PI双染经流式细胞仪进行检测。结果:荧光显微镜下、透射电镜和激光共聚焦显微镜下均可观察到典型的细胞凋亡形态,SGC-7901细胞随着给药剂量的增大,凋亡细胞特征性形态越明显。SGC-7901细胞经不同浓度的野西瓜极性生物碱A10组分作用48 h后,流式细胞仪直方图上出现亚二倍体峰,表明肿瘤细胞发生晚期凋亡。不同质量浓度的野西瓜极性生物碱A10组分作用24 h后,与空白对照组比较,各给药组SGC-7901细胞均发生不同程度的早期凋亡,且出现凋亡的比例逐渐增加。结论:野西瓜极性生物碱A10组分可以诱导SGC-7901细胞发生凋亡。 3野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901凋亡线粒体通路的研究 3.1野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞凋亡线粒体通路关键事件的影响 目的:研究野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞凋亡线粒体通路关键事件的影响,判断是否启动了线粒体凋亡通路。方法:Reagent A染色、罗丹明123染色、Western Blot法和酶标仪法。结果:在经过野西瓜极性生物碱A10组分作用后,SGC-7901细胞膜孔道不同程度的开放,膜电位发生了明显下降,并导致Cyt-c由线粒体释放至细胞浆,活化Caspase-9并启动Caspase级联反应,激活下游的Caspase-3从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。结论:野西瓜极性生物碱A10组分诱导肿瘤细胞凋亡是由于启动了线粒体凋亡途径。 3.2野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞凋亡线粒体通路调控因子的影响 目的:探讨ROS和钙超载是否参与了野西瓜极性生物碱A10组分诱导的细胞凋亡过程。阐明Bcl-2和Bax基因对野西瓜极性生物碱A10组分所诱导细胞凋亡线粒体通路的调控作用。方法:DCFH-DA染色、Fluo-3/AM探针染色、Western Blot法、流式细胞术和RT-PCR法。结果:SGC-7901细胞内活性氧水平随着野西瓜极性生物碱A10组分质量浓度的升高而升高,细胞内钙离子浓度也相应的增大。给药组Bcl-2蛋白表达水平与对照组相比有所下降,而Bax蛋白表达量随之增加。野西瓜极性生物碱A10组分能够降低Bcl-2基因的mRNA表达,上调Bax基因的mRNA表达,并且具有一定的剂量依赖性。结论:经野西瓜极性生物碱A10组分作用后,活性氧的聚集和钙超载激活了细胞凋亡线粒体机制。野西瓜极性生物碱A10组分通过调节基因的转录水平下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达来调控线粒体凋亡通 本论文通过HPLC法测得野西瓜中盐酸水苏碱含量为8.2257 mg·g-1,雷氏铵盐剩余比色法(以盐酸水苏碱计)测定野西瓜中总生物碱含量为104.7749mg·g-1。MTT法筛选出人胃癌SGC-7901细胞是野西瓜生物碱的敏感细胞株,野西瓜生物碱70%乙醇层是其抗肿瘤的活性部位,A10组分为野西瓜生物碱抗肿瘤活性组分,称之为野西瓜极性生物碱A10组分。并经HPLC法测得野西瓜极性生物碱A10组分中盐酸水苏碱含量为367.7296 mg·g-1。UV法测得野西瓜极性生物碱A10组分中生物碱含量(以盐酸水苏碱计)为784.2096 mg·g-1。实验发现,野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞生长增殖具有抑制作用,并通过诱导细胞凋亡的方式发挥其抗肿瘤作用。野西瓜极性生物碱A10组分迫使MPTP孔开放,促使线粒体膜电位的崩溃,并促进Cyt-c的释放,触动Caspase-9,启动Caspase级联反应,并最终激活了凋亡执行分子Caspase-3而诱导SGC-7901细胞凋亡。野西瓜极性生物碱A10组分通过钙稳态失衡,ROS积聚来调控SGC-7901细胞线粒体凋亡。野西瓜极性生物碱A10组分通过调节基因的转录水平下调Bcl-2蛋白表达,上调胞浆内Bax蛋白的表达,降低Bcl-2/Bax比例,进而调控凋亡的线粒体通路。 本研究的创新点 1.采用活性跟踪的方法进行野西瓜生物碱抗肿瘤活性组分的筛选 2.从定性和定量两个方面揭示野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡。 3.首次发现野西瓜极性生物碱A10组分通过启动线粒体通路诱导SGC-7901细胞凋亡。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R285

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10 苏琦;;DNA甲基化和组蛋白去乙酰化在人胃癌SGC-7901细胞RASSF1A基因失活中的相互作用[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 李如雪;感受A109国道[N];国际商报;2000年
2 ;风云渐起:我看联想A10F主板降价[N];科技日报;2000年
3 本报记者 张楠;A10深化中国布局[N];中国计算机报;2011年
4 本报驻柏林记者倪永华;A100:无“血栓”的交通大动脉[N];科技日报;2002年
5 A10网络;A10网络:IPv6迁移四问[N];通信产业报;2011年
6 义川;神州数码签下A10总代理[N];网络世界;2009年
7 本报记者 李响;A10 借神码发力中国应用交付市场[N];计算机世界;2009年
8 本报记者 逄丹;A10:后来者的自我超越[N];通信产业报;2010年
9 螃蟹;电脑淡季数码仍有不少看点[N];中国电脑教育报;2002年
10 ;每周行情[N];中国电脑教育报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 于蕾;野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡线粒体通路的研究[D];北京中医药大学;2010年
2 张文陆;大蒜素诱导SGC-7901细胞凋亡及机制的研究[D];中国医科大学;2010年
3 曲婷婷;活血行气方药物血清对人胃癌SGC-7901细胞株作用的实验研究[D];辽宁中医药大学;2011年
4 刘英霞;三氧化二砷(As_2O_3)抑制人胃癌细胞SGC-7901侵袭转移作用机理研究[D];兰州大学;2011年
5 伍韶斌;TKTL1基因沉默对胃癌SGC-7901细胞的影响及相关机制研究[D];中南大学;2011年
6 袁伟杰;EphA2基因沉默对胃癌SGC-7901细胞侵袭力的影响及相关机制研究[D];中南大学;2010年
7 郑国静;消痰散结方调控诱导型一氧化氮合酶表达抗胃癌血管生成的实验研究[D];第二军医大学;2005年
8 王吉旭;RNAi抑制G6PD表达对胃癌SGC-7901细胞的影响及相关机制研究[D];中南大学;2012年
9 卡尤姆;硫化氢供体S-炔丙基半胱氨酸对胃癌细胞SGC-7901和乳腺癌细胞MDA-MB 231及其肿瘤裸鼠模型的抗癌效应及分子机制研究[D];复旦大学;2011年
10 孙莹;Stat3特异性SiRNA抑制胃癌SGC-7901细胞生长的体内外实验研究[D];吉林大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 洪宝;冬凌草甲素调控周期相关蛋白抑制SGC-7901细胞增殖作用的研究[D];哈尔滨商业大学;2011年
2 尹峰;5,7-二甲氧基黄酮对人胃癌SGC-7901细胞生长和凋亡的影响[D];南华大学;2010年
3 王怡苹;蜂毒素对胃癌细胞系SGC-7901细胞的抑制作用及与细胞凋亡的关系[D];安徽医科大学;2010年
4 邹君君;三物白散对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响[D];湖南中医药大学;2010年
5 张舜尧;秦皮乙素诱导SGC-7901肿瘤细胞凋亡的实验研究[D];哈尔滨商业大学;2011年
6 呼明明;薯蓣皂苷诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡及作用机制研究[D];大连医科大学;2011年
7 韦丽兰;红景天苷对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响及抑瘤作用的初步研究[D];广西医科大学;2012年
8 王刚;紫花牡荆素对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及机制研究[D];南华大学;2011年
9 吴宝明;蜂毒素对SGC-7901细胞株增殖的影响及其部分作用机制研究[D];安徽医科大学;2010年
10 王媛媛;同源框基因A10、白血病抑制因子在输卵管积水患者子宫内膜的表达水平及其与体外受精—胚胎移植结局的相关性[D];广州医学院;2011年
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