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缺血性脑白质损害凋亡基因的活化及开心解郁方的干预机制

张颖  
【摘要】:脑白质病变(White matter lesion,WML)是发生于老年人的中枢神经系统的退行性疾病,其发病与脑缺血和年龄等因素有关,尤其是随着脑血管病患病率的增加,脑血管病患者中的的脑白质损伤的发生率也越来越高。脑组织缺血缺氧后多表现为小胶质细胞激活、星形胶质细胞胞体增大、突触增长、数量增多、胶质纤维酸性蛋白呈强阳性表达、少突胶质细胞损伤变性、甚至凋亡脱髓鞘及轴突损害、血管周围间隙扩大、白质内动脉硬化,临床多为抑郁及认知功能障碍等,有的甚至发展为痴呆。WML的发病机制目前还不十分明了,仍处于探索阶段,目前认为氧化应激,炎性损伤等参与了脑白质的损伤,导致神经胶质细胞的激活及凋亡,从而使得神经纤维发生脱髓鞘等病理改变。脑白质病变在中医归属于“郁证”、“呆病”、“文痴”、“脏躁”等疾病中,其病因多为老年人肾虚精亏,气血亏虚,神明失养,或痰瘀毒邪侵犯脑络,痹阻清窍,神明被抑,病机多为本虚标实,本虚为元气亏虚,标实为气、火、痰、瘀为病,临床辨证虚实夹杂较多见。开心解郁方是黄世敬老师通过多年临床实验总结出来的治疗血管性抑郁及的经验方,由开心散和四逆散两方加减巴戟天等中药等组成,具有培元补虚、疏肝理气、活血解郁的作用,经过长期的临床实践证明,本方对WML具有明显的防治作用,对改善感情淡漠、情绪异常等抑郁症状和认知功能障碍有明显的治疗效果。双侧颈总动脉结扎方法(2-VO)是目前比较普遍采用的复制缺血性WML的较好的动物模型,通过双侧颈总动脉结扎,可以造成全脑永久性完全缺血,形成大脑低灌注,因此本课题采用此方法复制脑缺血模型,通过动物实验观察脑缺血大鼠脑白质的超微结构改变及其发生机制,并探讨开心解郁方对WML的保护作用机理,寻找其作用靶点,为临床应用提供科学的理论依数据,并揭示中医治疗脑白质病变的科学内涵。 实验分为3部分: 1脑缺血大鼠行为学及脑白质的形态学观察:Wister大鼠双侧颈总动脉结扎(2-vessel-occulsion,2-VO)方法复制WML模型,实验动物分为3组:假手术组、模型组和治疗组,治疗组开心解郁方生药灌胃,每天一次,分别于缺血3天、7天、21天观察大鼠学习记忆能力的变化及与脑白质形态结构改变的关系。激光多普勒脑血流仪动态观察脑血流量变化,Morris水迷宫观察大鼠行为学变化,脑组织HE染色后,光镜下观察脑组织皮层下白质的大体结构变化;透射电镜观察额叶下白质超微结构的病理改变 2脑缺血后大鼠脑组织神经细胞凋亡及Bc1-2家族凋亡基因检测: Wister大鼠2-VO法复制WML模型,术后动物分为3组,假手术组、模型组和治疗组.治疗组开心解郁方生药灌胃,每天一次,缺血3天、7天、21天,观察大鼠脑组织的细胞凋亡及其相关凋亡基因的变化。脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidel transferase mediated uridine nucleotide end labeling, TUNEL)观察皮质及皮质下白质细胞凋亡的情况,RT-PCR法及Western法检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)和Bc1-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, bax)的mRNA及蛋白表达变化。 3脑缺血后大鼠氧自由基及核转录因子的检测: Wister大鼠2-VO法复制WML模型,术后动物分为3组,假手术组、模型组和治疗组,治疗组开心解郁方生药灌胃,每天一次,于缺血3天、7天、21天,观察SOD和HNE及NOS和N0与NF-κB的变化。生化法检测脑组织超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、一氧化氮(Nitric Oxide ,NO)和一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase, NOS),酶联免疫吸咐法(Enzyme linked immunsorbent assay. ELISA)法检测4-羟基壬烯酸(4-hydroxynonenal, HNE),免疫组化法观察大脑皮质及皮质下白质核转录因子(Nuclear transcription factorκB, NF-κB)的表达变化。 实验结果: 1开心解郁方对脑缺血大鼠脑白质形态结构及学习记忆能力的影响 脑缺血3天、7天、21天,水迷宫实验结果显示,模型组大鼠逃避潜伏期比假手术组时间延长,3天时有统计学意义(P0.01),治疗组与模型组比较,3个缺血时间点逃避潜伏期缩短,缺血3天有差异(P0.05)。脑血流结果显示缺血3天、7天、21天额叶及顶叶脑血流降低,与假手术组比较差异显著(P0.01或P0.05),治疗组脑血流提高,与模型组比较,缺血21天时有统计学意义(P0.05)。HE染色结果显示,3个缺血时间点假手术组神经纤维排列整齐,细胞形态正常,间质均匀淡染,模型组神经纤维排列稀疏、紊乱,脑白质结构疏松,组织有空泡变性,并随着缺血时间延长,病理改变越明显,治疗组与模型组比较,神经纤维排列较整齐,空泡变性稍减少,接近假手术组。透射电镜观察,假手术组脑白质神经髓鞘结构完整、致密,中心为轴突,其外有完整髓鞘包绕,并可见正常的胶质细胞排列,模型组髓鞘变性溶解,出现板层增厚,并有夹层,随着缺血时间的延长,脱髓鞘的病理改变越明显,少突胶质细胞可见损伤变性,随缺血时间延长,核固缩,核染色质趋边聚集,胞质呈空泡性等病理改变明显增多,治疗组髓鞘增厚及分层现象减少,胶质细胞变性减轻并接近假手术组。实验结果显示双侧颈总动脉结扎后,大脑处于低灌注状态,大鼠的学习记忆能力下降,脑白质也发生神经纤维脱髓鞘的病理改变,说明大脑低灌注可导致脑白质损伤,学习记忆能力下降,开心解郁方能够改善大鼠学习记忆能力,其机制有可能是通过提高血流量,减轻脑白质损伤来实现的。 2开心解郁方对脑缺血大鼠少突胶质细胞凋亡及Bc1-2基因的影响 TUNEL染色结果提示,3个时间点模型组白质与皮质一样,均有细胞凋亡且与缺血时间相关,21天凋亡细胞表达数最高,治疗组与模型组比较细胞凋亡率下降,仍高于假手术组。Bc1-2及Bax mRNA及蛋白检测结果显示,模型组Bc1-2mRNA及蛋白表达呈一致性降低(P0.01或P0.05)且21天时达到最低值, Bax mRNA及蛋白表达均增多并有统计学意义(P0.01或P0.05),并随缺血时间延长,呈持续上升趋势,21天表达为最高值,治疗组Bcl-2 mRNA及蛋白表达增加( P0. 05 ), Bax mRNA及蛋白表达降低(P0.05)接近假手术组。实验结果提示少突胶质细胞与神经元一样对缺血敏感易发生凋亡,Bc1-2凋亡基因的表达可能诱导了少突胶质细胞的凋亡,开心解郁方抑制少突胶质细胞的凋亡有可能是通过抑制Bax mRNA及蛋白的高表达,促进Bcl-2 mRNA及蛋白的表达实现的。 3开心解郁方对脑缺血大鼠氧自由基及NF-κB的影响 脑缺血3天、7天及21天,模型组SOD活性下降,HNE含量升高,3天、21天时与假手术组比较差异显著(P0.01或P0.05),治疗组3个缺血时间点SOD活性升高,HNE含量下降,缺血3天、21天与模型组比较差异显著(P0.05)。3个缺血时间模型组NO含量升高,NOS活性增强,与假手术组比较,缺血21天时有统计学意义(P0.01或P0.05),治疗组3天、7天时NO含量、NOS活性继续增加,缺血21天显著下降,与模型组比较有显著性差异(P0.05)。脑缺血3个时间,皮质及白质假手术组NF-κB几乎不表达,模型组NF-κB阳性细胞增多,并随着缺血时间延长而增加,21天达高峰,治疗组与模型组比较阳性细胞表达降低接近假手术组。实验结果提示,开心解郁方能够抑制NF-κB的表达,其干预途径有可能是通过降低包括NO在内的氧自由基的增加而抑制NF-κB的表达。 结论: 脑白质病变与抑郁及认知功能障碍密切相关,脑缺血可导致脑白质损伤,双侧颈总动脉永久性结扎是复制脑白质损伤的较为理想的模型,通过多年的临床实践证实开心解郁方对血管性抑郁具有较好的治疗作用,现通过动物实验对其疗效进行研究,为临床治疗提供理论实验依据。实验结果如下: 1双侧颈总动脉结扎使大脑低灌注,少突胶质细胞对缺血缺氧敏感而发生凋亡,神经纤维由少突胶质细胞包括轴突形成,少突胶质细胞凋亡导致神经纤维脱髓鞘,脑白质发生损伤,额叶及颞叶白质损伤可导致情感学习记忆中枢传递被阻断,大鼠表现为学习记忆能力下降,开心解郁方能够提高大鼠学习记忆能力,其作用机制有可能是通过保护受损脑白质来实现的。 2 Bc1-2基因家族是重要的凋亡基因,NF-κB作为核转录因子可以调控Bc1-2基因的表达,而氧自由基又可以激活NF-κB,促使其表达,本实验中,脑缺血导致自基由增加,过量的自由基一方面可以直接作用于线粒体膜,使其膜通透孔开放,Cyt-C释放入胞浆激活Ca spase系统,启动细胞凋亡,另外,作为细胞毒性物质激活NF-κB,使其表达增高,高表达的NF-κB激活Bax蛋白.活化的Bax蛋白激活Caspas-3,启动细胞凋亡。开心解郁方能够增加Bc1-2表达.抑制促凋亡蛋白Bax表达而达到保护神经细胞的作用,其作制途径有可能是通过降低氧自由基的增加,抑制NF-κB的活性来实现的减少细胞毒性作用来实现的。 总之,脑缺血后氧自由基等毒性质在体内蓄积,过多的自由基一方面对细胞直接产生毒性作用,促使其凋亡;同时,还能激活核转录因子NF-κB,使其活性升高,通过调控Bc1-2基因表达,促使少突胶质细胞凋亡,神经纤维脱髓鞘,脑白质发生病变,开心解郁方对脑白质具有保护作用,其作用机制有可能是通过降低氧化应激损伤途径,降低NF-κB活性,抑制Bax表达,促进Bc1-2表达来实现的。


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