雄黄纳米微粒在细胞水平抑制
【摘要】：呼吸道合胞病毒和腺病毒是儿童呼吸道感染的常见病原,这两种病毒具有致病力强,发病率高的特点,常因院内感染引起爆发流行,目前仍缺乏对呼吸道合胞病毒和腺病毒治疗较好的药物。国内外有关于雄黄治疗病毒性疾病的临床报道,尚无雄黄抗病毒的实验研究。本实验选择非阶段性的单链负股RNA病毒-呼吸道合胞病毒(respiratoy syncytialvirus,RSV)和属于双链DNA病毒-腺病毒(Adenovirus,ADV)为研究对象,观察雄黄纳米微粒抗人3型腺病毒(Human Adenovirus-3, HAdV-3)和RSV的作用。同时由于在HAdV-3感染早期,病毒为了最大限度地增殖与传播,抑制感染细胞凋亡,以保证自己能够在细胞凋亡前产生足够数量的子代病毒以及逃避宿主的免疫监视系统。本研究在腺病毒感染早期,通过观察雄黄纳米微粒对PI3-K (phosphatidylinositol3-kinase,磷脂酰肌醇3-激酶)/AKT (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog)通路的抑制作用,诱导腺病毒感染细胞凋亡,来探讨雄黄抗病毒的作用机制,揭示雄黄纳米微粒抗腺病毒分子靶点。
目的
1通过体外实验建立RSV和HAdV-3感染Hep-2的细胞模型,观察雄黄纳米微粒对细胞病变(Cytopathic effect, CPE)的抑制作用,并采用荧光定量RT-PCR和PCR的方法检测雄黄对RSV和HAdV-3病毒基因表达的影响,探讨雄黄纳米微粒抑制RSV和HAdV-3核酸复制的作用。
2研究雄黄纳米微粒在腺病毒感染早期诱导病毒感染细胞凋亡的机制。通过激光共聚焦显微镜观察雄黄纳米微粒干预腺病毒感染早期细胞凋亡情况。采用western-blot法观察雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞的AKT、p-AKT、NF-κB p65蛋白表达的影响,同时采用RT-PCR法检测雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞凋亡蛋白Fas L、Bc1-2、bax及p53mRNA基因表达的影响,探讨雄黄纳米微粒抑制PI3-K通路诱导腺病毒感染细胞凋亡而起到抗病毒的作用。
方法
1雄黄纳米微粒对腺病毒及呼吸道合胞病毒复制的影响：采用CPE抑制实验,通过预防给药、治疗给药及直接灭活给药三种方式,在细胞水平上观察雄黄纳米微粒对腺病毒和呼吸道合胞病毒感染Hep-2细胞病变的抑制作用；采用荧光定量PCR和荧光定量RT-PCR的方法观察雄黄纳米微粒对腺病毒和呼吸道合胞病毒基因表达的影响,探讨雄黄纳米微粒抗DNA病毒和RNA病毒的作用。
2观察雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞活性的影响：分别在腺病毒感染Hep-2细胞的24h、48h、72h和120h时,采用MTT方法观察不同浓度雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞A值的影响。
3雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞凋亡的影响：采用Annexin V/PI双染法激光共聚焦显微镜观察雄黄纳米微粒大剂量组和小剂量组在腺病毒感染24h时诱导病毒感染早期细胞凋亡的情况。
4雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞PI3-K通路的影响：采用western-blot的方法研究雄黄纳米微粒大剂量组和小剂量组在腺病毒感染24h时Hep-2细胞中AKT、 p-AKT、NF-κB p65蛋白表达的水平,探讨雄黄纳米微粒对PI3-K通路的影响。
5雄黄纳米微粒对腺病毒感染细胞凋亡调控蛋白FasL、P53、Bc1-2、Bax基因表达的影响：采用实时荧光定量RT-PCR的方法研究雄黄纳米微粒大剂量组和小剂量组,在腺病毒感染24h时细胞凋亡调控蛋白FasL、P53、Bc1-2、Bax mRNA的基因表达。
结果
1雄黄纳米微粒在预防、治疗及直接灭活三种给药方式下,均可减轻HAdV-3和RSV感染Hep-2细胞的CPE程度。其中,雄黄纳米微粒抗HAdV-3的半数有效浓度(IC50)分别为0.255μg/mL、0.142μg/mL、0.117μg/mL,治疗指数(TI)分别为2.55、4.57和5.55；雄黄纳米微粒抑制RSV感染Hep-2细胞病变的半数有效浓度(IC50)分别为0.20μg/mL、0.13μg/mL、0.16μ/mL,治疗指数(TI)分别为3.18、4.99和4.11。雄黄纳米微粒对HAdV-3和RSV感染Hep-2细胞CPE抑制作用均存在着量效关系。
2荧光定量PCR和RT-PCR检测雄黄纳米微粒对HAdV-3和RSV感染Hep-2细胞病毒复制量,结果显示Hep-2细胞对照组无扩增曲线,CT35,HAdV-3和RSV病原体检测均为阴性；雄黄纳米微粒(加腺病毒)组、利巴韦林(加腺病毒)组和腺病毒模型组扩增曲线的CT值分别为29.30±0.08、33.05±1.29、26.01±0.25,腺病毒病原体检测为阳性。与腺病毒组(66699932±23.85)相比,雄黄纳米微粒(加腺病毒)组的复制量(912435.44±16.57)和利巴韦林(加腺病毒)组的复制量(459124.84±12.82)均降低,具有显著性差异(P0.05)。雄黄纳米微粒(加呼吸道合胞病毒)组、利巴韦林组(加呼吸道合胞病毒)和呼吸道合胞病毒组扩增曲线的CT值分别为25.58±0.19、27.42±5.74、17.59±0.1,呼吸道合胞病毒病原体检测为阳性。与呼吸道合胞病毒组(70952000±46.14)相比,雄黄纳米微粒(加呼吸道合胞病毒)组的复制量(1123500±20.25)和利巴韦林(加呼吸道合胞病毒)组的复制量(426593.78±49.02)均降低,差异显著(PO.05)。
3通过MTT法和激光共聚焦显微镜观察雄黄纳米微粒诱导腺病毒感染Hep-2细胞凋亡,结果显示雄黄纳米微粒0.367μg/mL、0.184μg/mL、0.092μg/mL、0.046μg/mL剂量组在HAdV-3感染24h时可诱导HAdV-3感染Hep-2细胞凋亡,同时经激光共聚焦显微镜观察显示雄黄大剂量组的细胞凋亡较小剂量组更明显；当雄黄纳米微粒作用到48h时可减轻HAdV-3感染细胞病变,细胞存活率明显多于腺病毒对照组,其对腺病毒CPE的抑制作用可以持续至120h。
4雄黄纳米微粒可通过作用于PI3-K介导的信号通路,降低磷酸化AKT和NF-κB p65蛋白表达的水平,增加促凋亡蛋白P53、FasL、Bax mRNA表达,降低抑凋亡蛋白Bcl-2mRNA表达,说明雄黄纳米微粒可能在腺病毒感染早期诱导感染细胞凋亡,发挥抗病毒的作用。
结论
1本研究证实了雄黄纳米微粒具有抗腺病毒和呼吸道合胞病毒的作用,填补了雄黄抗病毒实验研究的空白；
2雄黄纳米微粒可在腺病毒感染早期通过抑制PI3-K通路,降低AKT的磷酸化,促染早期细胞凋亡,从而起到抑制腺病毒复制的作用。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 抗病毒作用 PI3-K通路 雄黄纳米微粒 腺病毒 细胞凋亡 【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R373
【目录】：
- 中文摘要5-8
- Abstract8-11
- 英文缩略词表11-12
- 上篇 文献综述12-40
- 综述一 雄黄的制备和现代药理作用研究概况12-23
- 1 雄黄的制备、表征12-13
- 2 雄黄的粒度分析方法13
- 3 雄黄复方的药代动力学研究13-14
- 4 雄黄现代药理作用的研究14-18
- 5 雄黄临床治疗病毒感染性疾病18
- 6 雄黄毒副作用18-19
- 结语与展望19
- 参考文献19-23
- 综述二 中西医治疗呼吸道合胞病毒和腺病毒感染性疾病的研究进展23-40
- 1 中医病毒感染性疾病的认识23-27
- 2. 中药抗病毒的实验研究27-30
- 3 西药抗腺病毒和呼吸道合胞病毒的研究进展30-35
- 结语与展望35
- 参考文献35-40
- 下篇 实验研究40-91
- 第一部分 雄黄纳米微粒抗呼吸道合胞病毒和腺病毒的研究40-69
- 前言40-42
- 实验一 雄黄纳米微粒体外抗HAdV-3和RSV的增殖作用42-61
- 材料与方法42-49
- 结果49-58
- 讨论58-60
- 参考文献60-61
- 实验二 雄黄纳米微粒对HAdV-3和RSV基因表达的影响61-69
- 材料与方法61-64
- 结果64-66
- 讨论66-67
- 参考文献67-69
- 第二部分 雄黄纳米微粒抑制PI3-K/AKT途径诱导腺病毒感染早期细胞凋亡的研究69-91
- 前言69-70
- 实验三 雄黄纳米微粒在HAdV-3感染不同时间对Hep-2细胞生存率的影响70-74
- 材料与方法70-71
- 结果71-72
- 讨论72-73
- 参考文献73-74
- 实验四 雄黄纳米微粒对腺病毒感染早期细胞凋亡的影响74-91
- 材料与方法74-79
- 结果79-85
- 讨论85-89
- 参考文献89-91
- 致谢91-92
- 个人简历92
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