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《北京中医药大学》 2012年
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基于DC疫苗的抗原提呈探讨加减理冲汤治疗宫颈癌的实验研究

李向英  
【摘要】:目的:本实验采用加减理冲汤联合DC疫苗作用于荷瘤小鼠,观察其对小鼠瘤组织中免疫抑制因子TGF-β1、 IL-6的影响,研究小鼠脾脏中CD4-、CD8+T细胞数量的变化,探讨DC疫苗用于宫颈癌患者免疫治疗的可行性及中药是否可使肿瘤微环境中免疫抑制因子减少,从而增强机体对DC疫苗的敏感性,为生物中药模式在肿瘤治疗中的应用提供实验依据。 方法: 1.小鼠模型建立:取对数生长期U14细胞用计数板计数,将浓度调整至1×106个/0.2ml接种于小鼠背部皮下,接种5d后开始抑瘤实验。 2.DC疫苗制备:取生长状态良好的U14细胞,经射线照射灭活后反复冻融制备肿瘤细胞抗原。颈椎脱位法处死小鼠,无菌状态下取骨髓细胞,体外经细胞因子GM-CSF、 IL-4等的诱导培养即可得到小鼠骨髓来源的树突状细胞。将小鼠骨髓来源的DC与灭活的肿瘤细胞抗原混合培养,即得到肿瘤抗原致敏的DC疫苗,流式细胞仪鉴定DC表型。 3.抑瘤实验:将造模成功小鼠随机分成4组,每组5只:对照组5只,腹腔注射生理盐水0.2ml/只,每天1次,连续15天;中药组5只,给予加减理冲汤灌胃0.2ml/只,每天1次,连续15天;加减理冲汤和DC疫苗联合组5只,给予加减理冲汤0.2ml/只,给予DC疫苗肿瘤局部注射一次,一周后重复上述步骤;DC疫苗组5只,给予DC疫苗肿瘤局部注射共两次,中间间隔一周。描绘肿瘤生长曲线,称量瘤重,计算抑瘤率。 4.免疫组化检测:免疫组化SP法测小鼠瘤组织中TGF-β1、 IL-6细胞因子的表达情况及脾脏中CD4+、 CD8+T细胞的数量。 5.R-T PCR法检测小鼠瘤组织中TGF-β1、 IL-6细胞因子的表达情况。 结果: 1.DC鉴定:倒置显微镜观察,培养第7天的DC可见树突样突起或毛刺状突起,大部分悬浮生长。经流式细胞仪鉴定,CDllc+CD86+DC纯度为89%,表明为典型成熟DC。 2.小鼠移植瘤生长状况:接种后3~5天在小鼠U14细胞注射部位可触及大米粒大小的质硬结节,6~8天开始出现肉眼可见的肿块。随着接种时间增加,各组小鼠肿瘤逐渐增大。小鼠成瘤率为100%(20/20) 3.各组荷瘤小鼠的生长状态:实验开始时各组小鼠生长状态均良好,对照组小鼠接种瘤细胞15天后,体重开始下降,出现活动量少、消瘦等表现;中药组,联合用药组和DC疫苗组小鼠状态较好,食欲旺盛,体重无明显下降趋势。 4.中药和DC疫苗对小鼠移植瘤的影响:接种后1-7天,肿瘤生长基本相 5.同;8~15天,对照组肿瘤生长明显快于其它组,联合用药组肿瘤生长最慢;处死小鼠,称取各组移植瘤瘤重,对照组、DC疫苗组、中药组和联合组瘤重分别为(2.794±0.004)g,(2.447±0.005)g,(2.285±0.005)g,(1.803±0.005)g,各用药组瘤重均低于对照组(P0.05),各用药组组间两两比较均有统计学意义(P0.05);按抑瘤率计算公式得出,DC疫苗组、中药组、联合组抑瘤率分别为12.42%、18.22%、35.47%,联合组抑瘤率最高,其次为中药组、DC疫苗组,三组组间两两比较均有统计学意义(P0.05)。 6.免疫组化结果:采用麦克奥迪数码医学图像分析软件对免疫组化结果行定量分析,对照组、中药组、DC疫苗组、联合组中TGF-β1蛋白的表达量分别为(0.467±0.003)、(0.137±0.004)、(0.466±0.003)、(0.139±0.003);IL-6蛋白的表达量分别为(0.476±0.006)、(0.136±0.003)、(0.474±0.004)(0.138±0.005);CD4+T细胞所占百分比分别为(0.099±0.003)、(0.209±0.002)、(0.106±0.002)、(0.216±0.006);CD8+T细胞所占百分比分别为(0.146±0.005)、(0.297±0.003)、(0.153±0.004)、(0.301±0.008)。中药组和联合组TGF-β1、IL-6的表达分别与DC疫苗组、对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05)而中药组与联合组相比、DC疫苗组与对照组相比,差异均无统计学意义(P0.05)。中药组和联合组CD4+、CD8+T细胞所占百分比分别与对照组、DC疫苗组相比,差异均有统计学意义(P0.05);而DC疫苗组与对照组相比、中药组与联合组相比,差异均无统计学意义(P0.05)。 7. R-T PCR结果:采用实时定量PCR技术对对照组,中药组,DC疫苗组,联合组中TGF-β1, IL-6蛋白的表达进行定性及半定量分析。对照组、DC疫苗组、中药组、联合组中TGF-β1mRNA基因表达分别为:(0.762±0.002),(0.760±0.001),(0.547±0.004),(0.485±0.005),IL-6mRNA基因表达分别为:(0.737±0.003),(0.730±0.005),(0.490±0.002),(0.487±0.005)。中药组和联合组TGF-β1、1L-6的表达分别与DC疫苗组、对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05);而中药组与联合组相比、DC疫苗组与对照组相比,差异均无统计学意义(P0.05)。 结论: 1.本研究观察到注射U14细胞至C57BL/6小鼠数量达1×106及以上时可形成肿瘤,少于此量时较难或不形成肿瘤。 2.加减理冲汤作用于荷瘤小鼠,可以下调肿瘤组织中免疫抑制性细胞因子TGF-β1及IL-6的表达,减轻肿瘤微环境中的免疫抑制。从而增强宿主对DC疫苗的敏感性,启动宿主主动性抗肿瘤免疫。 3.加减理冲汤联合DC疫苗作用于荷瘤小鼠,能够上调小鼠脾脏中CD4+CD8+T细胞的数量,提高小鼠外周免疫系统的抗肿瘤免疫应答能力,产生良好的治疗效果。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R737.33

【引证文献】
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