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柴黄益肾颗粒对糖尿病肾病大鼠肝损伤L-FABP及相关炎症因子的影响

王红盼  
【摘要】:目的: 糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的微血管并发症之一,在我国终末期肾病的患者中有20%-40%的原发病为DN,给国民经济造成严重负担,是全社会亟需解决的重大公共卫生问题。DN发病机制复杂,目前尚未完全阐明,中医药在治疗DN方面具有明显的特色与优势。近年研究表明炎症因子与炎症反应在DN的发生发展中起着极为重要的作用,认为其与DN病变时全身微炎症状态有关,但是关于炎症在DN并发的肝脏损伤中发挥的作用却有待深入研究。本研究通过观察柴黄益肾颗粒对DN大鼠肝损伤肝组织中肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)及相关炎症因子表达的影响,在验证柴黄益肾颗粒药物作用基础上,以DN诊断标记物L-FABP以及相关炎症因子为切入点,探讨柴黄益肾颗粒对DN大鼠肝组织炎症损伤的保护作用机制,并在此基础上借助重组质粒细胞转染实验验证这一机制。 方法: 1.中药柴黄益肾颗粒对DN大鼠肝损伤肝组织L-FABP及相关炎症因子表达的影响:采用单侧肾切除加链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立1型糖尿病肾病大鼠模型,随机分为模型组、柴黄益肾颗粒组和蒙诺组,另将假手术组设为对照组。分别于第0、4、8、12、16、20周动态观察大鼠一般状态、体重、血糖,第20周时动物取材,测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(CH0)、甘油三酯(TG),HE染色观察肝组织病理变化;RT-PCR检测各组大鼠肝脏L-FABP、PPAR-α、 PPAR-γ和MCP-1mRNA的表达,Western Blot检测大鼠肝脏L-FABP表达变化。 2.大鼠L-FABP/pcDNA3.1/V5-His重组质粒的构建及对相关炎症因子的影响:RT-PCR方法从大鼠肝脏组织总RNA中扩增出编码L-FABP的cDNA,克隆至pUM-T载体、测序,然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,双酶切鉴定及测序正确,采用磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,转染72h后,提取细胞总RNA和蛋白,RT-PCR检测空载体组和重组质粒转染组的L-FABP、PPAR-α、PPAR-γ、MCP-1、TGF-β1等mRNA水平的表达变化。Western Blot检测L-FABP和TGF-β1表达变化。 3.相关实验数据统计学处理采用SPSS13.0软件。 结果: 1.中药柴黄益肾颗粒对DN大鼠肝损伤肝组织L-FABP及相关炎症因子表达的影响:模型组从实验第0周起,状态与体重即明显差于对照组,且随实验的进行差异持续增加,到第20周差异达峰值,与模型组相比,各给药组大鼠状态均有明显改善,柴黄益肾颗粒组体重从第4周起显著升高并持续至实验结束;20周末,模型组大鼠CHO、TG均高于对照组(P0.05),而模型组肝组织中L-FABP. PPAR-α、PPAR-γ mRNA表达水平较对照组明显降低(P0.05),MCP-1mRNA表达水平明显高于对照组(P0.05);柴黄益肾治疗组CHO.TG均低于模型组(P0.05),柴黄益肾治疗组肝组织中L-FABP. PPAR-α、PPAR-γmRNA表达水平均较模型组明显升高(P0.05),而柴黄益肾治疗组中MCP-1表达受到抑制;两治疗组之间比较差异无统计学意义。 2.大鼠L-FABP/pcDNA3.1/V5-His重组质粒的构建及对相关炎症因子的影响:1)测序结果证实PCR扩增得到编码L-FABP的cDNA序列正确;2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,在基因和蛋白表达水平结果达到预期;3)RT-PCR结果显示重组质粒转染组的PPAR-α、PPAR-γmRNA表达增加,MCP-1、p65及TGF-β1的mRNA表达降低(P0.05),4) Fugene HD法转染HepG2细胞后,PCR结果显示下游基因变化不明显,可能与细胞自身L-FABP的表达有关。 结论: 1.柴黄益肾颗粒能够改善1型糖尿病肾病肝组织炎症病理损伤,其作用机制可能与L-FABP、PPAR-α、PPAR-γ表达的增加,进而降低下游炎症因子MCP-1等的表达有关,L-FABP可能在DN的肝损伤中起到重要的修复作用。 2.成功构建了大鼠L-FABP的重组质粒,使该重组质粒在293T细胞中过表达,初步研究了其可能影响的下游因子,为探讨大鼠L-FABP重组质粒的功能提供有力证据。而在HepG2细胞中过表达该重组质粒,下游基因变化不显著,可能与该细胞中自身表达L-FABP有关。


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