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苦碟子对缺氧损伤血管内皮细胞的保护作用及PKCδ/MARCKS通路的调节

于佳澜  
【摘要】:背景 豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C的底物(myristoylated alanine-rich C kinase substrate, MARCKS)是蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)的特异性底物蛋白。既往的动物实验发现脑缺血损伤时PKCδ/MARCKS信号通路异常激活。那么在体外培养细胞中,PKCδ/MARCKS信号通路是否参与了血管内皮细胞的缺氧损伤,中药苦碟子注射液是否能够通过下调PKCδ/MARCKS通路活性从而起到缺氧损伤保护作用,其机制有待阐明。 目的 证实PKCδ/MARCKS信号通路的激活介导了血管内皮细胞缺氧损伤;阐明苦碟子注射液通过下调PKCδ/MARCKS信号通路活性起到了缺氧保护作用,为深入研究中药在缺氧损伤中的保护机制提供确切依据。 方法 1建立CoCl2诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)缺氧损伤模型,并应用苦碟子注射液、PKCδ特异性抑制剂Rottlerin进行干预。 2观察缺氧损伤HUVEC细胞的形态学改变,及药物干预后的变化。 3MTT比色法检测缺氧损伤HUVEC细胞的活力,及药物干预后的变化。 4免疫细胞化学法(IHC)及固定蛋白印迹法(Western Blot)检测缺氧损伤HUVEC细胞PKCδ、 MARCKS磷酸化蛋白的分布与表达,及药物干预后的变化。 5实时荧光定量PCR (Quantitive Real time PCR)法检测缺氧损伤HUVEC细胞PKCδ、 MARCKS mRNA的表达。 结果 1HUVEC细胞缺氧损伤后,细胞形态发生了明显的缺氧改变,苦碟子、Rottlerin可减轻这种改变。 2HUVEC细胞缺氧损伤后0.5h、1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h,细胞活力较正常组明显降低(P0.05或P0.01),苦碟子、Rottlerin可明显增强细胞活力(P0.05或P0.01)。 3PKCδ、 MARCKS磷酸化蛋白在缺氧损伤HUVEC细胞中表达异常增加(P0.05),其主要分布于细胞膜,苦碟子、Rottlerin可显著抑制其活性(P0.05)。 4HUVEC细胞缺氧损伤后PKCδ、 MARCKS mRNA表达明显增加(P0.05),而苦碟子、Rottlerin可抑制其mRNA表达(P0.05)。 结论 1应用苦碟子与Rottlerin干预C_oCl_2诱导的HUVEC细胞缺氧损伤模型,可减轻细胞缺氧形态学改变,增强细胞活力,显示苦碟子、Rottlerin具有血管内皮细胞缺氧保护作用。 2PKCδ、 MARCKS蛋白磷酸化活性及PKCδ、 MARCKS mRNA表达在缺氧损伤HUVEC细胞中异常增高,而PKCδ选择性抑制剂Rottlerin可降低PKCδ、 MARCKS活性,并减轻细胞缺氧损伤,证实PKCδ/MARCKS通路的激活介导了HUVEC细胞缺氧损伤。 3苦碟子注射液通过下调PKCδ/MARCKS信号转导通路的活性,从而起到细胞缺氧保护作用,提示PKCδ/MARCKS可能是中药缺氧保护治疗的新靶点。


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