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《北京中医药大学》 2013年
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四逆散疏肝解郁防治肝纤维化作用与骨形态发生蛋白4的关联机制研究

王晓曈  
【摘要】:肝脏是人体内最大的腺体,肝脏在物质代谢,生物转化(药物毒素),分泌和排泄(胆汁),凝血抗凝血,免疫防御诸多方面都有重要的作用。全球每年因患慢性肝病死亡的患者高达80万人。肝脏疾病如病毒性肝炎、毒物或药物导致的肝病等均伴有不同程度的肝损伤,严重的肝损伤会导致肝纤维化、肝硬化,最终导致肝衰竭。目前针对肝硬化、肝衰竭等晚期肝病最佳的有效治疗是肝移植。但是,由于缺乏可移植的肝脏、病情延误恶化、患者身体虚弱等等原因使得肝移植只能对25-30%的患者实施,并且成功率较低。 四逆散出自《伤寒论》张仲景方,由柴胡、枳实、白芍、甘草四味药组成,具有透邪解郁、疏肝理脾之功效。现代研究认为四逆散加味具有显著改善肝脏微循环,保护肝细胞及抗肝纤维化的作用。方中柴胡始载于《本经》,具有疏肝解郁、透达郁热,为君药。柴胡皂苷A (SSa)是柴胡的有效成分之一,其在肝脏中具有抗炎、抑制肝癌细胞增殖、抗氧化等的作用。 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是由Urist于1965年首次从成人骨组织中提取到的一种活性蛋白质,属于TGF-β超家族。BMP在生物体中发挥着非常重要的作用,能够诱导骨及软骨的形成,调节细胞增殖、分化及凋亡,还参与心脏,肝脏,’肾脏,肺脏,神经,肌肉等的发育,铁的代谢等。其中BMP4参与肝脏胚胎发育、肝脏形成、肝细胞增殖、分化及肝损伤、肝纤维化等肝脏生理病理过程,但其作用尚未完全揭示。 基于上述基础,我们认为BMP4在肝脏疾病尤其是肝损伤中扮演重要的角色,BMP4与肝损伤的关系值得进一步研究。另外,SSa作为四逆散君药的主要成分,具有一定的防治肝纤维化的功效,这种作用的机制有待进一步深入研究,同时SSa在针对肝纤维化疾病作用的同时是否对肝脏重要相关生长因子BMP4有调节作用也非常值得深入研究。 因此,本课题共分为三个部分:一、BMP4在D-gal诱发的肝损伤模型中的表达及其机制研究,探讨肝毒性药物D-gal对Huh7细胞形态是否存在影响;D-gal及BMP4对Huh7增殖的作用,以及两者是否在细胞增殖中存在相互作用;D-gal对BMP4mRNA、蛋白表达水平的影响以及BMP4信号传导通路相关蛋白的研究;BMP4在肝细胞的分化中的作用。二、四逆散组方中主要成分对肝星状细胞BMP4作用的筛选,对SSa、芍药苷(Peoniflorin, PF)、橙皮苷(Hesperidin, HES)、柚皮苷(Naringin, NRG)、甘草酸(Glycyrrhizic acid, GA)进行筛选,观察其对LX-2细胞BMP4表达的影响。三、柴胡皂苷A在肝星状细胞活化中对BMP4的调节作用研究,对SSa在肝星状细胞中对BMP4表达、肝星状细胞增殖、活化、凋亡的影响分别进行了深入研究。实验结果和结论如下: 1.BMP4在D-gal诱发的肝损伤模型中的表达变化及其机制 D-gal对Huh7细胞的形态无影响;D-gal显著抑制Huh7细胞的增殖,不同浓度的BMP4对Huh7细胞的增殖没有显著影响,BMP4及BMP4抗体对D-gal的细胞增殖抑制作用无显著影响;D-gal刺激后,Huh7细胞BMP4mRNA、蛋白表达明显升高,并与时间、剂量呈相关性;BMP4通过诱导Smadl及ERK1/2的磷酸化进行信号传导;BMP4对胆管上皮细胞表面标记物CK-19、肝细胞表面标记物Albumin mRNA的表达无影响,说明BMP4对Huh7细胞的分化未产生作用。 2.四逆散组方中主要成分对肝星状细胞BMP4作用的筛选结果 PF(芍药苷)、HES(橙皮苷)、NRG(柚皮苷)、GA(甘草酸)作用24h后BMP4mRNA表达无明显变化;SSa(柴胡皂苷A)能够明显降低BMP4mRNA的表达(P0.05);HES能够显著增加BMP4蛋白表达(P0.05), SSa显著抑制了BMP4蛋白表达(P0.05)。 3.柴胡皂苷A在肝星状细胞活化中对BMP4的调节作用 SSa显著抑制BMP4mRNA及蛋白的表达;SSa显著抑制LX-2细胞的增殖,BMP4对LX-2细胞增殖无影响,SSa对肝星状细胞的增殖抑制诱导肝星状细胞凋亡可能是SSa防治肝纤维化的机制之一;BMP4显著诱导了α-SMA蛋白的表达; SSa显著抑制了α-SMA蛋白的表达,并且能够改变BMP4对LX-2细胞α-SMA蛋白的作用,说明SSa通过抑制α-SMA蛋白的表达从而抑制肝星状细胞的活化诱导肝星状细胞凋亡可能是SSa防治肝纤维化的机制之一;SSa能够诱导促凋亡蛋白Bax的表达升高,说明SSa诱导肝星状细胞凋亡可能是SSa防治肝纤维化的机制之一。 总之,上述结论表明BMP4在肝损伤中起着非常重要的作用,SSa是四逆散中能够有效抑制BMP4表达的成分之一,并且其防治肝纤维化的作用可能是通过抑制肝星状细胞增殖、活化、诱导凋亡实现的。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R259

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