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《北京中医药大学》 2013年
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高血压病证结合动物模型及其肝火亢盛证的生物学基础研究

马雪玲  
【摘要】:目的 构建稳定的高血压病证结合动物模型,探寻临床四诊信息和模型动物的相似性和关联性,寻找能够反映高血压肝火亢盛证动物模型相对应的替代指征,明确其较为稳定的证候时间窗。结合高血压疾病与证候特征性基因共发生网络和高血压病证候与理化指标的文献研究结果,建立高血压肝火亢盛证宏观与微观相结合的特征性证候判别模式,初步揭示高血压肝火亢盛证的生物学基础,为高血压病的客观化诊断提供依据,为高血压中医药研发及药效学评价提供可靠的载体,搭建中医基础研究与临床研究沟通的桥梁。 方法 1采用GenCLip2.0online platform实时从Pubmed全文数据库中检索与原发性高血压相关的所有文献,对高血压病异常表达基因进行功能聚类分析,构建高血压疾病和证候的特异性基因共发生网络。 2结合KEGG通路富集分析、GO-ANALYSIS等文献挖掘技术,探寻高血压密切相关基因调控通路及蛋白信号分子,进一步构建高血压与应激相关基因的共发生网络。 3运用复杂系统熵数据挖掘技术,对高血压常见证型与理化指标之间的复杂关联性进行分析,从密切关联的指标中探寻不同证型高血压病的共性病理改变以及反映不同证型特有病理特征的核心指标。 4采用目前文献报道的与人类原发性高血压最为相似的2种高血压疾病模型:自发性高血压大鼠模型及应激性高血压大鼠模型,通过全面动态宏观表征采集、行为学试验以及微观理化指标的动态检测,进行疾病的稳定性评价,并结合临床四诊信息与动物表征的等效转化,进行证候属性的辨识。5基于现代社会人们所遭受的各种慢性社会、心理应激等高血压危险因子,分别给予高血压肝火亢盛证大鼠慢性温和应激和反复强烈应激,观测其应激状态下的宏观表征、行为学及微观理化指标的变化。 6采用Elisa法检测大鼠血清中文献研究结果所提示的与高血压证候密切相关的微观理化指标,免疫组织化学法对大鼠脑区的单胺类神经递质的表达进行定位分析,高效液相色谱法(HPLC)进行定量分析。 7运用氢核磁共振(1H-NMR)技术对高血压肝火亢盛证大鼠及其应激状态下血浆中的内源性小分子代谢产物的进行全面鉴定和差异性比较分析。 结果 1基因层面—高血压疾病与证候及应激调控基因的文献研究结果 原发性高血压(EH)密切相关前100位基因功能聚类分析结果:动态血压(昼夜节律)主要受ACE,AGT,AGTR1,ALB,AVP,B2M,CAT,CRP, EEF1A2,FLNA,LEP,NOVA2,PTH,REN,SOD1,TNF等基因调控;调控肾素-血管紧张素-醛固酮系统系统及交感神经系统活性的基因:ACE, ACE2, ADIPOQ, AGT, AGTR1, ALB, APOE, AVP, CCL2, CRP, CYP11B2, DBP, EDN1, EEF1A2, ELN, EPO, FOXD3, HMGCR, ICAM1, IGF1, IL1B, IL6,REN等;与血管内皮功能障碍相关的基因有ACE,ADIPOQ, AGT, AKT1, ALB, APOE, B2M, CALCA, CAT, CCL2, CD59, CRP, MAPK1, MME, NOS1, NOS3等。 EH密切相关基因KEGG_PATHWAY通路富集结果:Renin-angiotensin system:ACE, REN, ACE2, MME, AGT, LNPEP, AGTR1; Aldosterone-regulated sodium reabsorption: MAPK1, HSD11B1, NR3C2, HSD11B2, IGF1, INSR; Cytokine-cytokine receptor interaction Calcium signaling pathway:EDNRA,AGTR1, ADRB2, NOS1, ADRB1, NOS3, NOS2, HTR2A; NOD-like receptor signaling pathway:MAPK1, CARD8, IL6, TNF, CCL2, IL1B。 EH前100位基因中有61位基因与机体对外界应激的反应、机体内氧化应激反应以及应激保护等机制相关,其中20位基因与机体对外界的应激反应相关。 以高血压密切关联基因为背景基因,以高血压肝火亢盛证诊断标准中症状所对应的西医名称为关键词进行基因聚类分析,发现其中与高血压肝火亢盛证密切关联的基因主要为RAAS系统关键级联基因REN, ACE, AGT以及细胞色素P450家族CYP2D6。 2微观理化指标层面—高血压证候相关理化指标文献研究结果 文献研究结果提示与高血压肝火亢盛证型关联性较强的理化指标主要有超声心动、丙二醛、血栓素A2、前列腺素、血栓素B2、ACE、内皮素等;甘油三酯、低密度脂蛋白、颈动脉斑块积分、高密度脂蛋白及颈动脉内膜—中膜厚度等指标与高血压痰湿壅盛证型关联性较强提示该证型的脂质代谢紊乱最为显著;高血压阴虚阳亢证中24h动态血压信息量化值最大,提示改证型血压变异性最为显著;而阴阳两虚证中与LEVF值的降低相关性最强,提示该证型心功能下降最为显著。 3高血压动物模型疾病的稳定性评价: 应激性大鼠模型血压随应激强度及时间的增加波动明显,血压呈短暂性的升高,去除应激因子2周后,血压低于140mmHg诊断标准。其病情与应激强度及时间有明显的相关性,且有自然恢复趋势。 自发性高血压大鼠12周龄时血压已明显升高SBP波动在176mmHg,血压随周龄增长持续升高,至14-18周龄达到相对稳定的水平,叠加反复强烈应激后,血压升高幅度更大。病情相对稳定,因此可作为中医证候观察及中药药效学评价的首选模型。 4高血压动物模型证候属性判别: 自发性高血压大鼠于14-18周龄出现易激惹程度评分明显增加,旋转耐受时间缩短,耳、爪部血管数量增多及充盈度增加,舌、爪部图像R值升高、舌质干少津、被毛干枯蓬乱,便质干硬、排便时间延长,旷场试验总活动距离、穿格次数及直立次数明显增加。参照高血压证候诊断标准,基于临床证候诊断标准进行动物宏观表征表征等效转化的方法,初步认为SHR14-18周龄符合肝火亢盛证的诊断标准。 应激性高血压大鼠,组内个体差异较大,应激后大鼠血压升高的程度与应激时间并不同步,而宏观表征及行为学等表现组内差异更为明显,症状轻重程度不一,证候的稳定性、均一性较差。 5高血压肝火亢盛证大鼠及其应激状态下外周血管活性物质差异性分析 14-18周龄SHR(肝火亢盛证)大鼠血清AngⅡ、NE、TXB2、ET、NPY、HCY、CORT含量均与12、13、20周龄(非肝火亢盛证)相比有明显差异,而5-HT、CGRP、6-Keto-PGF1α等指标未见明显差异。高血压肝火亢盛证大鼠应激干预后血清中ET、AneⅡ、HCY、NPY、5-HT、NE、CORT等水平明显高于无干预组高血压肝火亢盛证大鼠。 6高血压肝火亢盛证大鼠及其应激状态下中枢单胺类神经递质含量分析 高血压肝火亢盛证大鼠海马组织内除E含量与正常大鼠无明显差异外,其他指标NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT含量均较正常组大鼠显著升高,且应激状态下高血压肝火亢盛证大鼠NE含量升高更为显著。 7高血压肝火亢盛证大鼠及其应激状态下1H-NMR血浆代谢产物的比较分析 1H-NMR图谱及模式识别分析发现:自发性高血压大鼠与正常组大鼠OPLS/O2PLS-DA积分矩阵图沿第一主成分t(1)轴方向均可完全分开,且无明显交叉和重叠,表明自发性高血压大鼠与正常组大鼠血浆成分代谢产物谱有显著性差异。同时研究发现14-18w高血压肝火亢盛证大鼠给予应激干预后:反复强烈应激组与无干预组血浆成分代谢产物有明显差异,而正常组大鼠给予应激干预后不论是温和应激还是反复强烈应激组血浆代谢产物与对照组相比均无明显差异。 结论 1本研究采用文献挖掘与数据挖掘相结合的方法,构建了高血压疾病基因网络,证候关联基因及关联微观理化指标,从基因层面和微观理化指标层面为高血压证候生物学基础研究提供了新的方法。 2选择与人类原发性高血压发病机制相似的自发性高血压大鼠模型和应激性高血压大鼠模型,通过全面动态宏观表征采集和行为学评价,以高血压临床证候诊断标准为依据进行临床信息与动物表征的等效转化,初步辨识其证候属性,并结合微观理化指标及代谢组学与证候的相关性分析,建立了宏观表征与微观指标相结合的高血压肝火亢盛证判别模式。 3高血压肝火亢盛证大鼠及其应激状态下微观理化指标的改变及其关联性分析,提示高血压肝火亢盛证可能的生物学机制为RAAS系统的激活和交感神经活性的增强—“高肾上腺素能特征”和多巴胺能亢进以及相继发生的血管内皮功能障碍。初步认为AngⅡ、 NE、ET、TXB2可作为肝火亢盛证的客观化诊断指标。1H-NMR模式分析提示差异代谢物与证候及证候相关理化指标之间存在相关性,有望成为证候客观化诊断的指标。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R259;R-332

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