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基于Nrf2/ARE通路辛开苦降方胃康宁对人胃粘膜上皮细胞SOD2、GSTP1相关调控机制的研究

常玉娟  
【摘要】:背景:功能性消化不良(functional dyspepsia, FD)是指一组无器质性(organic pathologic changes与功能性相对)原因可究的,以持续性或反复性发作的上腹部疼痛、胀满、嗳气及早饱等为主要症状的临床症候群,是消化系统的常见病,占国内消化门诊的20%-50%。F D的病因和发病机制现代医学尚不明确,目前主要认为与胃肠动力障碍、内脏敏感性异常、幽门螺旋杆菌感染、胃肠激素的改变、脑一肠轴功能障碍、精神心理障碍、遗传易感性等多方面因素有关。目前5-HT激动剂类等调节胃肠动力类药物包括替加色罗、西沙比利、莫沙必利、普卡比利、伦扎必利等,在对抗FD方面表现出了良好的疗效,但安全记录难以令人完全放心。替加色罗会导致患者的心肌梗死、心源性猝死等心血管时间风险增加,西沙比利QT间期延长、室性心动过速及心脏骤停。FD病因和机制的复杂性和不明确性,患者临床症状的多样性和反复发作性,给FD一一种虽不会危及患者生命,但却严重影响患者生命质量的疾病的治疗带来一定的难度。在用药的安全性,对患者身心症状的整体调节以及复发率的改善方面,中医药治疗功能性胃肠病表现出了一定的优势。中药胃康宁以辛开苦降法为基本治法,治疗功能性消化不良效果明确,在临床上得到广泛应用。研究表明胃康宁可通过调节FD患者胃壁肌电活动和自主神经功能,从而起到治疗作用。但其作用的分子机制仍有待于进一步阐明。在我们前期的研究中,应用蛋白组学技术筛选FD大鼠正常组、模型组胃康宁给药组表达具有明显差异的蛋白点,经质谱鉴定,与正常组相比,其中VDAC1, GSTP1, Enolase, SOD2这4个蛋白在模型组表达量下降,胃康宁给药后表达量又上调。电压依赖性阴离子通道(Voltage-dependent anion channel 1, VDAC1),位于在线粒体上的结合位点的线粒体外膜蛋白,可以促进ATP的释放,从整体上调节细胞的能量代谢水平。烯醇化酶(Enolase)是糖酵解中的关键酶,可通过参与调节能量代谢来满足细胞生长所需能量。二者的状态在调节线粒体内外的物质代谢和能量代谢中发挥着非常重要的作用,与细胞的生存密切相关。SOD2,即超氧化物歧化酶2,主要分布在线粒体,是细胞内部重要的抗氧化系统组成,能够通过减少超氧阴离子等超氧化物,维持氧化抗氧化平衡。谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases, GSTs)作为Ⅱ相解毒酶,可清除体内有害物质、保护DNA及一些蛋白质免受损伤。(GSTs)和  Superoxide dismutases (SODs)是细胞内重要的抗氧化的酶系,能自发的对抗氧化应激(Oxidative Stress),具有帮助细胞抵御外来毒物与活性氧簇的毒害和损伤的效应。本实验将在细胞水平,对VDAC1、Enolase、SOD2、GSTP1这四个靶点进行进一步研究,探讨在胃黏膜上皮细胞中,胃康宁对GSTP2、SOD2、VDAC-1、 Enolase等蛋白的表达调控作用,及转录因子Nrf2对GSTP2、SOD2、VDAC-1、 Enolase等蛋白的调控机制,以及这种调控作用对细胞生物学功能的影响,进一步探索辛开苦降方胃康宁治疗FD的机制,为临床上FD的防治研究提供可借鉴的基础研究数据和新的思路。目的:在前期蛋白组学的基础上,观察胃康宁对能量代谢相关指标VDAC1、 Enolase以及细胞内部重要的抗氧化物质SOD2、GSTP1的影响,以及胃康宁通过转录因子Nrf2对GSTP1、SOD2、VDAC-1、Enolase等蛋白的调控机制,研究胃康宁对胃粘膜GES-1细胞氧化应激损伤的保护作用及其相关机制。方法:体外培养人胃GES-1细胞,MTT和CCk8法检测细胞增殖和活力,运用RT-PCR法和Western b lot法检测胃康宁在基因和蛋白水平对VDAC1、 Enolase、SOD2、GSTP1的影响。Western blotting检测评价Nrf2核内和胞质蛋白水平,激光共聚焦法观察Nrf2核转位情况,实时定量PCR检测Nrf2及其下游基因NQO1、HO-1、GCLM 和 GCLC mRNA表达水平。分别建立Nrf2过表达(OE Nrf2细胞)和沉默细胞株(shNrf2细胞),Western blotting检测评价Nrf2过表达和沉默效果;通过RT-PCR和Western blot实验观察胃康宁在Nrf2基因过表达和抑制表达时GSTP1、SOD2等蛋白的表达变化。通过细胞功能学实验,微量酶标法测定胃黏膜上皮GES-1细胞还原型谷胱甘肽(GSH)含量和丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法(羟胺法WST-1法)测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,分别检测正常阴性对照细胞(shMock细胞)及Nrf2沉默情况下细胞(shNrf2细胞)GSH、MDA含量和SOD活性,以及胃康宁分别对shMock细胞和shNrf2细胞GSH、MDA含量以及SOD活性的影响。结果:研究发现胃康宁在基因和蛋白水平上均可促进VDAC1、Enolase、 SOD2、GSTP1的表达(P0.05)。胃康宁能显著诱导Nrf2核转位,其下游Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化酶基因NQO1、GCLC、GCLM 和 HO-1 mRNA表达水平也显著增加(P0.05),并且具有时间和浓度依赖性。Nrf2过表达可导致GES-1细胞中SOD2、GSTP1表达增高(P0.05);而当GES-1细胞Nrf2的表达被siRNA-Nrf2抑制后,胃康宁诱导SOD2和GSTP1基因mRNA和蛋白表达水平升高的能力也随之减弱(P0.05)。正常GES-1细胞中,与空白组相比,胃康宁干预组MDA水平明显降低(P0.05),SOD的活性上调(P0.05),GSH含量显著升高(P0.05)。在Nrf2沉默细胞中,胃康宁这种保护细胞抗氧化应激的能力则大大降低,并且shNrf20.05组与shMock 0.05组,shNrf20.3组与shMock 0.3组相比,MDA水平显著上升(P0.05), SOD的活性以及GSH含量则均明显下调(P0.05)。结论:1.胃康宁能促进胃黏膜上皮GES-1细胞能量代谢相关指标VDAC1、Enolase以及细胞内部重要的抗氧化物质SOD2、 GSTP1的表达。2.胃康宁能通过激活Nrf2、ARE通路,调节SOD2、GSTP1等蛋白的表达,以此调节细胞能量代谢水平,及抗氧化应激应答,以维持细胞能量代谢及氧化应激平衡,保护胃肠组织生物膜免受损伤,可能是中药胃康宁治疗功能性消化不良的作用机理之一。3.功能性消化不良患者胃组织氧化应激水平升高,可能是功能性消化不良发生、发展的环节之一。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是机体最重要的内源性抗氧化酶,还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)是机体内最重要的非酶性抗氧化剂。胃康宁对内源性抗氧化剂的上调可能是其抗氧化作用的重要机制之一。


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