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《北京中医药大学》 2017年
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利用免疫亲和色谱柱特异性敲除甘草酸的研究

曾文浩  
【摘要】:目的:制备甘草酸免疫亲和色谱柱,特异性敲除甘草提取液中的甘草酸,对比敲除前后甘草提取液的抗炎效果;对比三种常用药用甘草:乌拉尔甘草、胀果甘草及光果甘草的抗炎物质基础是否存在差异。1.甘草酸免疫亲和色谱柱的方法学考察,考察免疫亲和色谱柱的特异性,载样量,敲除率,稳定性,精密度与准确度等参数。2.利用制备的甘草酸免疫亲和色谱柱特异性敲除甘草提取液中的甘草酸等成分,通过HPLC及LC/MS鉴定敲除成分。3.对比甘草提取液敲除前后抗炎作用差异,分析甘草酸与甘草抗炎作用的关联性。4.对比三种不同甘草敲除前后抗炎作用的差异,分析不同种类甘草的抗炎作用物质基础的差异。方法:利用小鼠腹水生产法制备大量抗甘草酸单克隆抗体,制备甘草酸免疫亲和色谱柱,对甘草提取液进行敲除研究,对比不同甘草敲除甘草酸前后抗炎作用的差异。1.小鼠腹水生产法大量生产抗甘草酸单克隆抗体,测定抗体的效价以及交叉反应与竞争性,确定抗体的特异性。并采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水,通过SDS-PAGE鉴定抗甘草酸腹水抗体纯化情况。2.利用纯化好的抗甘草酸单克隆抗体与CNBr活化的琼脂糖凝胶偶联制备甘草酸免疫亲和色谱柱。偶联过程包括:凝胶的活化与溶胀、凝胶清洗、抗体偶联、封闭、装柱、平衡等过程,制备了免疫亲和色谱柱。考察了制备的色谱柱的偶联率、特异性、载样量、精密度、准确度与稳定性等色谱柱参数,从而对色谱柱的效能进行评价。3.取2.0mg/mL的甘草提取液1.OmL,通过甘草酸免疫亲和色谱柱,经上样、敲除、洗脱、平衡步骤,敲除甘草提取液中甘草酸类成分,利用HPLC测定甘草提取液敲除前后的色谱图谱,通过LC/MS技术对敲除成分的结构进行分析鉴定。4.通过甘草酸免疫亲和色谱柱敲除三种甘草提取液中的甘草酸,以LPS诱导小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7分泌IL-6及TNF-α为指标,通过对比敲除前后三种甘草的药效作用,观察甘草酸在甘草抗炎研究中对炎症细胞分泌IL-6及TNF-α的抑制作用。并对比三种甘草提取液敲除前后对IL-6及TNF-α分泌的抑制作用,分析三种甘草抗炎作用的物质基础。结果:1.经测定,甘草酸腹水的效价能达到1:64000,且抗体的竞争性良好,其线性范围为78.12-2500.0 ng/mL之间,在线性范围内建立线性回归方程,回归方程为:y =-0.189ln(x)+ 1.7113,(R2=0.9973)。交叉反应结果显示,甘草酸的单抗腹水除与甘草次酸有交叉反应(31.57%)外,与其他类化合物则不产生交叉。对抗甘草酸腹水进行纯化,经SDS-PAGE鉴定,纯化后的单抗纯度达到98%。2.制备了甘草酸免疫亲和色谱柱,经蛋白定量计算,甘草酸单抗与琼脂糖凝胶的偶联率为74.9%,偶联比5.99:1。采用去离子水-甘氨酸盐酸(pH=2.7)缓冲液作为色谱柱的缓冲液系统,考察色谱柱的最大载样量达到1 326.11 μg(110.51 μg/g凝胶),稳定性试验表明在32天以内,亲和色谱柱敲除率的相对标准偏差值为1.37%,即色谱柱具有良好的稳定性,精密度与准确度考察结果显示敲除不同浓度甘草酸样品所得到的回收率的RSD=0.65%,RE=0.37%,符合方法学要求。3.对三种甘草提取液敲除结果表明,甘草酸免疫亲和色谱柱能特异性敲除提取液中的:18β甘草酸、甘草皂苷A3、甘草皂苷G2、22-乙酰氧基甘草酸、乌拉尔甘草皂苷A单铵盐、云甘苷G1、18α-甘草酸。4.研究三种甘草提取液敲除前后对LPS诱导RAW264.7细胞炎症的抑制作用,结果显示,乌拉尔甘草提取液组中IL-6及TNF-α含量分别为1.27±0.009pg/mL、7.63±0.100 pg/mL,低于LPS组中IL-6及TNF-α水平(1.31±0.006pg/mL、7.95±0.107pg/mL),且差异有显著性(P0.05);乌拉尔甘草敲除液组中IL-6及TNF-α含量分别为7.89±0.013 pg/mL、1.33±0.055 pg/mL,与LPS组差异无显著性(P0.05);乌拉尔甘草提取液敲除前后IL-6及TNF-α含量有显著性差异(P0.05),胀果甘草及光果甘草提取液敲除液前后的IL-6及TNF-α含量无显著性差异(P0.05)。结论:本实验首次制备了甘草酸免疫亲和色谱柱,并将其应用于甘草提取液的成分敲除研究;本实验首次通过免疫亲和色谱技术制备敲除甘草酸成分的甘草提取液阴性样本,结果表明甘草酸是甘草抗炎作用的主要活性成分;本实验首次对比三种不同甘草敲除阴性样本的抗炎功效,结果表明,乌拉尔甘草中主要抗炎活性成分为甘草酸,而光果甘草及胀果甘草除甘草酸外还存在其他特殊的抗炎活性物质。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:O657.7;R284.1

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