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中药鸡血藤的质量控制及对斑马鱼抗血栓作用的初步研究

杨冉冉  
【摘要】:目的:鸡血藤为豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎,主产于广西、广东、云南,具有活血补血、舒筋活络、调经止痛的功效,现代药理研究表明,鸡血藤具有抗血栓、抗肿瘤、降脂、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌等药理作用。市场上所用的鸡血藤品种较为复杂,除《中国药典》收载的密花豆外,还有豆科、五味子科、木通科等6科12属的植物,如白花油麻藤、山鸡血藤、大血藤等,它们的化学成分不同。此外,由于栽培品和野生品不加区分,采收时间不同、加工炮制方法不同、贮藏运输差异等因素,药材质量参差不齐,导致鸡血藤药材及其制剂的质量在实际生产过程中难以控制,制约了鸡血藤产品的国际化进程。《中国药典》(2015年版)尚未规定鸡血藤的含量测定项,为保证其质量可控,本实验建立鸡血藤指纹图谱结合多成分含量测定的质量控制模式,从而使鸡血藤药材质量可控,同时也保证以鸡血藤为原料药的制剂及中成药的安全有效。近年来,斑马鱼凭借其便捷、快速、成本低、可高通量筛选的优势成为大家研究的热点。因此本实验采用盐酸肾上腺素诱导建立活体斑马鱼血栓模型,以斑马鱼尾静脉红细胞染色面积为定量指标,研究鸡血藤的抗血栓活性,并筛选其抗血栓的活性部位,为其临床应用提供科学依据,也为其他抗血栓药物的筛选提供新思路新方法。方法:(1)采用高效液相色谱法(HPLC)结合相似度评价、聚类分析、主成分分析(PCA)三种分析方法,建立鸡血藤的HPLC指纹图谱。(2)采用HPLC法同时测定鸡血藤中原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、芒柄花素、甘草素、美迪紫檀素6个化学成分的含量,为鸡血藤药材的质量标准改进提供科学数据。(3)采用超高液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF/MSE)法结合UNIFI数据库对鸡血藤中的化学成分进行快速的推断鉴定,为其药效物质基础研究提供数据。(4)采用盐酸肾上腺素诱导斑马鱼血栓模型,以斑马鱼尾静脉红细胞染色面积为定量指标,筛选鸡血藤的抗血栓活性部位,为其临床应用提供理论数据。结果:(1)建立了 17批鸡血藤药材及4批鸡血藤伪品药材的HPLC指纹图谱,经比较,两者有显著的差异。鸡血藤药材的HPLC指纹图谱共确定了 35个共有峰,通过标准品指认出6个共有峰,采用相似度评价、聚类分析、主成分分析三种方法对17批鸡血藤药材进行质量评价。结果显示,共4个产地的17批药材质量不一,不同产地的药材有较大的差异,同一产地药材也有差异,但整体的相似度较高,与标准图谱相比,各批次的相似度在0.816~0.968范围内,相似度在0.9以上的药材占64.70%。聚类分析与主成分分析结果显示,17批药材中,广西产地的S5,云南产地的S11、S16,越南产地S15质量较好。(2)实验建立了鸡血藤中原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、甘草素、芒柄花素、美迪紫檀素6个化学成分的HPLC含量测定方法,测定了 17批药材中6个化学成分的含量,原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、甘草素、芒柄花素、美迪紫檀素的含量分别为0.250~0.898、1.447~5.662、1.759~11.925、0.035~0.134、0.218~0.535、0~0.585 mg·g-1。表儿茶素和儿茶素的含量较高,均高达1mg·g-1,其他4个成分的含量相对较低。方法学考察表明该实验方法的精密度、重复性、稳定性及加样回收率均符合相关标准。此方法不仅为评价鸡血藤药材的质量提供参考,也可为《中国药典》完善标准提供科学数据。(3)实验采用UPLC-Q-TOF/MSE技术结合UNIFI数据库对鸡血藤中的化学成分进行推断鉴定,通过对正、负离子模式下的质谱数据进行分析,共推断鉴定出17个化合物,同时总结归纳了鸡血藤中黄酮类化合物的裂解规律。(4)实验采用盐酸肾上腺素诱导的斑马鱼血栓模型,确定了盐酸肾上腺素浓度大于等于30 μmol·L-1时血栓模型稳定,并运用该模型筛选出鸡血藤的抗血栓活性部位,结果表明鸡血藤水提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物在一定浓度下均有一定的抗血栓活性,但水提取物较乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和二氯甲烷提取物的血栓抑制率更大,抗血栓活性更强,当暴露浓度为20 μg/mL时,水提取物组的血栓抑制率高达 82.96%。结论:本实验建立了鸡血藤HPLC指纹图谱结合6个化学成分含量测定的质量控制模式,较全面地评价鸡血藤药材的质量,为《中国药典》完善标准提供科学数据;运用UPLC-Q-TOF/MSE技术结合UNIFI数据库对鸡血藤中的化学成分进行快速的推断鉴定,为鸡血藤的药效物质基础研究提供科学数据,有利于鸡血藤的进一步开发与应用;实验验证了斑马鱼血栓模型,同时筛选了鸡血藤药材的抗血栓活性部位,为鸡血藤的临床应用提供科学数据,同时也为其他抗血栓药物的筛选提供新思路新方法。


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