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《北京中医药大学》 2019年
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红花注射液质量标准研究及基于斑马鱼血栓模型的活性评价初探

刘新  
【摘要】:中药注射液化学成分复杂、质量控制指标单一,不利于全面评价其质量,因此,完善质量控制指标是全面评价中药注射液质量的必由之路。红花注射液是由中药红花(Carthamus tinctorius L.)制成的中药注射液,临床上广泛用于治疗闭塞性脑血管疾病、冠心病、脉管炎等症,属于活血化瘀类中药注射液。目的:本文针对红花注射液化学成分复杂、药效物质不明确、现有质量控制指标单一等问题,利用UPLC-MS/MS液质联用技术、斑马鱼血栓模型活性评价法、UPLC法等对红花注射液进行全面分析。优化现行质量标准中指纹图谱项和含量测定项下部分内容,为完善红花注射液质量控制指标提供数据支持和实验依据,这对于全面控制和提升红花注射液的质量具有重要意义。方法:首先利用UPLC-MS/MS液质联用分析方法定性分析红花注射液的化学成分;再利用斑马鱼血栓模型评价经大孔树脂洗脱的红花注射液不同洗脱部位的抗血栓活性及红花注射液中所含的单体成分的抗血栓活性,筛选出活性较好的抗血栓活性成分,将其作为质量控制指标。测定收集的市售各批次红花注射液总黄酮含量是否符合现有标准,在此基础上,建立UPLC对照指纹图谱,并对活性较好的成分进行定量分析。1)建立红花注射液的UPLC-MS/MS液质联用分析方法,定性分析红花注射液所含化学成分。为了检测到更全面的信息,分别在ESI正、负离子模式下进行质谱检测。2)基于本课题组已有的斑马鱼血栓模型,建立对红花注射液成品-洗脱部位-单体成分的活性评价研究方法。根据预实验结果分别确定红花注射液、各洗脱部位、单体成分作用于斑马鱼(受精后5天,5 days past fertilization,5dpf)的最大非致死浓度(MNLC),并在MNLC下选择3~5个由低到高的浓度梯度为低、中、高给药浓度进行药效活性研究。给药处理16小时后,用邻联茴香胺染色液染色,DMSO清洗后,在体视显微镜下(60×)观察斑马鱼尾静脉红细胞聚集情况并拍照记录,再用Image Pro plus6.0图像处理软件对斑马鱼尾静脉血栓红细胞染色面积进行定量分析,实验重复3次,并计算血栓抑制率。3)采用紫外-可见分光光度法测定红花注射液总黄酮(以山奈酚计)含量;采用UPLC法建立红花注射液UPLC指纹图谱。用紫外-可见分光光度法、UPLC法结合相似度评价、聚类分析对27批红花注射液进行质量评价。4)采用UPLC法,建立同时测定27批红花注射液及3批红花注射液中间体(煎煮浓缩液、一次脱醇浓缩液、二次脱醇浓缩液、热处理前浓缩液、热处理后浓缩液)中5个成分含量的方法。根据含量测定结果,分析红花注射液及红花注射液中间体中的5个活性成分的质量变化规律。结果:1)在ESI正、负离子模式下,根据分子离子峰的精确分子量信息在10ppm的质量偏差范围内计算其可能的元素组成与分子式,根据二级质谱碎片信息、文献报道数据、保留时间和对照品对照,在红花注射液中共推测鉴定出32个化合物。其中,黄酮类成分17个,核苷类成分4个,苯丙素类成分5个,多炔类成分1个,其他类成分5个。2)红花注射液在0.25%~4%原液浓度范围内对斑马鱼血栓模型有明显得抗血栓活性,且随浓度增大抗血栓活性增强,具有浓度依赖性和模型的良好适用性。根据血栓抑制率结果得出抗血栓活性顺序排名前四(从高到低)为:红花注射液原液羟基红花黄色素A40%乙醇洗脱(8Z)-癸烯-4,6-二炔-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。同时,筛选出20%乙醇洗脱部位、60%乙醇洗脱部位、对羟基肉桂酸也具有不同的抗血栓活性。用UPLC法对四个洗脱部位进行色谱检测,发现四个单体成分在各洗脱部位的对应关系如下:20%乙醇洗脱部位以羟基红花黄色素A为主要色谱峰,60%乙醇洗脱部位以(8Z)-癸烯-4,6-二炔-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为主要色谱峰,40%乙醇洗脱部位均有四个单体成分的色谱峰,而在水洗脱部位中四个成分色谱峰不明显。提示可以将羟基红花黄色素A、对羟基肉桂酸、(8Z)-癸烯-4,6-二炔-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷作为重点研究指标。3)27批红花注射液的总黄酮(以山奈酚计)含量平均为0.491mg·mL-1,范围在0.387~0.646mg·mL-1,符合现行药品标准中规定的含量范围(0.20~0.70mg·mL-1),说明这27批红花注射液样品合格,可用于后续各项实验。建立了红花注射液UPLC对照指纹图谱,得出13个共有峰,指认出5个共有峰,27批样品的相似度达0.980,相似度高。分别以总黄酮含量、共有峰面积为变量进行聚类分析,当判别距离都为6时,前者将27批样品分为两类,后者将27批样品分为三类。用总黄酮和UPLC指纹图谱两种分析方法从不同角度对红花注射液进行质量稳定性评价。4)UPLC测定5种成分在选定的范围内线性关系良好(r0.9996),平均回收率在98.65%~101.70%,RSD2.04%(n=6)。红花注射液中间体中的5个成分在各工艺节点的含量变化较大,尿苷、鸟苷、对羟基肉桂酸和(8Z)-癸烯-4,6-二炔-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在二次脱醇浓缩后的含量达到最高,平均含量分别为0.8690、0.7054、0.3920、1.2299mg·mL-1,羟基红花黄色素A在一次脱醇浓缩后含量达到最高,平均含量为25.0625 mg.mL-1。市售27批红花注射液中尿苷、鸟苷、羟基红花黄色素A、对羟基肉桂酸、(8Z)-癸烯-4,6-二炔-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量分别分布在0.1148~0.1793、0.0118~0.0801、0.1959~0.9426、0.0501~0.0830、0.1919~0.2280mg·mL-1。结论:本文以红花注射液为研究对象,运用现代分析方法较为全面地定性分析了红花注射液所含的化学成分;并基于斑马鱼血栓模型对红花注射液成品-洗脱部位-单体成分的活性评价研究模式,推测抗血栓活性可能与羟基红花黄色素A、对羟基肉桂酸及(8Z)-癸烯-4,6-二炔-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷有关。本文收集的27批红花注射液质量合格且稳定性好,建立的UPLC对照指纹图谱,共有峰多,耗时短,27批红花注射液的相似度高。UPLC法测定红花注射液中间体5个成分的含量,在热处理后浓缩液中各成分的含量趋于稳定。UPLC法测定成品中5个成分的含量,羟基红花黄色素A的含量差异最大,不同企业的样品相差2~3倍。提示羟基红花黄色素A的含量是控制红花注射液质量稳定的重要指标。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R285.5;R-332;R286.0

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