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《北京中医药大学》 2002年
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中药抗呆Ⅰ号对脑缺血再灌注星形胶质细胞因子的影响

宋锐锋  
【摘要】: 星形胶质细胞为中枢神经系统主要的胶质细胞,正常情况下它们通过调节离子及其它代谢物浓度、神经递质的转运等保持内环境稳定,脑缺血后星形胶质细胞异常活跃,它通过分泌生长因子、细胞因子、识别因子等修复损伤的神经元,起到恢复神经系统正常功能的作用,但其具体机制仍不清楚,本研究以此为切入点从以下两方面进行研究:第一,用我室已建立的小鼠前脑缺血再灌注模型探讨脑缺血后海马星形胶质细胞GFAP、BDNF和BDNFmRNA、bFGF、bcl-2和bax表达的动态变化及抗呆Ⅰ号的影响;第二,用我室已建立的体外模拟脑缺血再灌注模型观察了体外除氧去糖情况下星形胶质细胞表达BDNF、bFGF的动态变化及抗呆Ⅰ号的影响,以期探讨在缺血性脑损伤中星形胶质细胞产生部分营养因子和与凋亡有关的因子的变化规律,进一步阐明缺血性脑损伤的机制,且为抗呆Ⅰ号的临床应用提供更完善的实验依据。 1.抗呆Ⅰ号对小鼠前脑缺血再灌注损伤海马星形胶质细胞表达部分营养因子和与凋亡有关的因子作用的实验研究 本研究应用昆明小鼠前脑缺血再灌注模型,免疫组化染色观察海马星形胶质细胞损伤后的动态变化,以及抗呆Ⅰ号的干预作用。 1.1模型的制备: 模型组以水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉,颈正中切口,用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉加鼠尾尖放血造成低血压,缺血15min后再灌15min,再次缺血15min,整个缺血过程中小鼠置于恒温箱内,保持肛温于36℃左右。假手术组除不阻断血流、不放血外余同前。正常对照组不做任何处理。分别在缺血再灌注损伤后1d、3d、7d、10d和15d取材染色处理。 免疫组化染色:采用ABC法。 1.2 抗呆Ⅰ号对脑缺血后小鼠海马星形胶质细胞GFAP、BDNF和bFGF蛋白表达动态变化影响的实验研究 前脑缺血再灌注1d只有少数星形胶质细胞表达GFAP,再灌注3d表达GFAP的阳性细胞数增加,再灌注7-10d表达GFAP的阳性细胞数达到高峰,同时,可见细胞反应性胶质化特征,前脑缺血再灌注15d GFAP阳性反应细胞数仍维持在较高水平。用药组GFAP的表达细胞数较模型组明显减少。而正常对照组和假手术组只有少数星形胶质细胞表达GFAP。且星形胶质细胞表达GFAP的强弱与神经细胞的存亡有关。 WP=61.3 抗呆Ⅰ号对脑缺血后小鼠海马星形胶质细胞bcl-2和bax蛋白表达的动态变化影响的实验研究 前脑缺血再灌注3~7d bcl-2表达呈强阳性。再灌注7~10d bax表达呈强阳性。用药组bcl-2和bax的表达较模型组均减弱。而正常对照组和假手术组无bcl-2和bax的表达。且星形胶质细胞表达bcl-2和bax的强弱与神经细胞的存亡有关。 在体模拟脑缺血再灌注损伤实验提示:损伤后星形胶质细胞反应性增生肥大,突起增粗,特异性蛋白GFAP表达增强,处于活化状态, 模型组BDNF和bFGF表达明显,一方面,通过把产生的营养因子分泌到组织间隙促进神经元恢复;另一方面,通过自身修复、调节内环境的稳定、清除代谢产物等环节,保护损伤的神经元。另外,通过表达与凋亡相关基因bcl-2与bax来调节自身和神经细胞的凋亡。用药后星形胶质细胞反应性增生减弱,各种因子表达减少,充分说明其对缺血再灌注损伤的保护作用。 2.抗呆Ⅰ号对体外模拟脑缺血后星形胶质细胞BDNF、bFGF蛋白动态变化影响的实验研究 模型的制备:将正常培养的传代星形胶质细胞按实验要求分为正常对照组、模型组、用药组(天麻素25mg/L)。正常对照组的培养孔中加入有糖Earle,s液,模型组加入无糖Earle,s液,用药组加入无糖Earle,s液+抗呆Ⅰ号。模型组和用药组培养板置缺氧罐中,通入93%N2+7%CO2的混合气,持续30min,将缺氧罐封闭置37℃培养箱中5h,取出培养板。正常组和模型组换完全培养液,用药组换完全培养液+抗呆Ⅰ号,根据实验要求继续培养2h、6h、18h、28h、48h和72h取出进行免疫组化染色。 免疫组化染色:采用ABC法,结果采用图像分析技术处理。 体外模拟脑缺血再灌注不同时间点BDNF和bFGF免疫组化染色显示,正常细胞胞体较大,各时间点光密度值和面密度均较模型组和用药组低;模型组各时间点光密度值和面密度均为最高;用药组各时间点光密度值和面密度值处于以上两者之间,各组间采用方差分析均有显著性差异。 体外模拟脑缺血再灌注损伤实验提示:损伤后星形胶质细胞反应性增生肥大,表达BDNF和bFGF明显增强,此为一种保护性反应,除增强自身的修复外,还可能对神经细胞有保护作用。用药组较模型组细胞反应性增生减弱,提示抗呆Ⅰ号可减轻缺血再灌对星形胶质细胞的损伤作用。 综上所述,在整体实验中抗呆Ⅰ号可减轻星形胶质细胞的损伤,使得星形胶质细胞的反应性胶质化程度减弱,用药组GFAP、BDNF、bFGF、bcl-2和bax的表达细胞数较模型组明显减少,在离体实验中抗呆Ⅰ号可使培养的星形胶质细胞损伤减轻,BDNF、bFGF蛋白表达减少,其机制可能是通过稳定内环境、增加对缺血缺氧的耐受性等作用减轻海马星形胶质细胞在脑缺血再灌注中的损伤,从而恢复和加强其对神经细胞的保护作用。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R277.7

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