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《北京中医药大学》 2003年
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马钱子对骨关节炎中软骨细胞凋亡与增殖的影响

张梅  
【摘要】:目的: 探讨通络药马钱子及其主要单体成分马钱子碱、士的宁对骨关节炎中软骨细胞凋亡及其合成代谢功能的影响。 方法: 1.通过在体实验观察马钱子对兔膝骨关节炎的保护作用。按Hulth法造兔膝骨关节炎模型,用通络药马钱子高、中、低剂量进行灌胃治疗,连续2月后取材,进行肉眼大体观察后,取股骨滑车部软骨及胫骨平台处软骨,分别于HE染色后光镜下观察,铀-铅双重染色透射电镜下观察各组的病理变化。 2.通过建立软骨细胞体外培养体系,探讨马钱子及其主要单体成分马钱子碱、士的宁对骨关节炎中软骨细胞凋亡及其合成代谢功能的影响。 (1) 用流式细胞仪及MTT法观察马钱子及马钱子碱、士的宁对正常培养的软骨细胞凋亡与增殖的影响; (2)将硝普钠(SNP)、全反式维甲酸(ATRA)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)分别加入软骨细胞培养体系,建立三种不同途径诱导的软骨细胞凋亡模型,观察马钱子及马钱子碱、士的宁对不同途径诱导的软骨细胞凋亡的影响,采用Annexin v/PI双参数法以及DNA电泳法、透射电镜对软骨细胞凋亡进行定量、定性检测。并通过对三种凋亡模型中NO含量的检测,以了解三种凋亡途径之间的关系以及马钱子对软骨细胞凋亡的进一步作用机制。 (3)采用同位素标记3H-TdR、3H-Pro、35S-Na2SO4掺入法测定软骨细胞DNA含量、以及合成胶原、蛋白多糖的功能,观察软骨细胞在凋亡过程中合成代谢变化,以及马钱子在调节软骨细胞凋亡与增殖时,软骨细胞合成代谢功能的情况。 结果: 1.对软骨退变的保护作用:通过病理学观察,发现马钱子对兔膝骨关节炎动物模型有一定保护作用,马钱子高、中剂量组可延缓膝骨关节炎模型中的软骨退变。 2. 对正常软骨细胞凋亡的影响:马钱子、马钱子碱、士的宁高中低剂量,对体外培养正常的兔软骨细胞无诱导其凋亡作用,士的宁加入体外培养正常的兔软骨细胞中,可使其坏死率上升。 3.对正常软骨细胞增殖的影响:马钱子及马钱子碱在一定浓度时,对正常软骨细胞有一定促增殖的作用,其中马钱子碱在提高兔软骨细胞增殖率方面,有一定的量效关系,以高剂量为好。士的宁对兔软骨细胞增殖率有一定的抑制作用,其中以高剂量士的宁对兔软骨细胞增殖抑制最强。 4.对软骨细胞凋亡模型的影响:在兔软骨细胞培养体系中分别加入2mmol/LSNP,10-4mol/L ATRA24 h后,在人胚胎软骨细胞培养体系中加入30ng/ml人TNF-а24h后,均可成功建立软骨细胞凋亡模型。马钱子及马钱子碱,在高、中剂量时可明显降低SNP、ATRA诱导的软骨细胞早期凋亡,以马钱子碱高剂量作用最显著。士的宁各剂量组不能抑制SNP、ATRA诱导的软骨细胞凋亡。马钱子、马钱子碱、士的宁各剂量组对人TNF-а诱导的软骨细胞的晚期凋亡,无明显抑制作用 5.对诱导软骨细胞凋亡途径的探讨:通过对三种凋亡模型中NO含量的检测,发现SNP、TNF-а这二种途径诱导软骨细胞凋亡可能是通过NO途径,其诱导软骨细胞发生凋亡与NO明显升高有关,ATRA诱导软骨细胞凋亡可能是通过非NO途径实现,这个途径不依赖NO。马钱子及其单体马钱子碱在一定剂量时,对不同途径下诱导的软骨细胞凋亡均有抑制作用。 6.对软骨细胞DNA、蛋白多糖、胶原合成的影响:马钱子、马钱子碱高中剂量组有明显促进兔软骨细胞DNA合成及分泌蛋白多糖的作用,且有一定的量效关系。而二者各剂量组对胶原无明显的促进合成作用。软骨细胞在发生凋亡时,其合成DNA、分泌蛋白多糖及胶原功能也发生相应下降,马钱子及马钱子碱高剂量在抑制软骨细胞凋亡的同时,对软骨细胞合成代谢功能有一定的改善功能。 WP=7 结论:通络药马钱子对兔膝骨关节炎有一定保护作用,对正常软骨细胞,有促进增殖而无诱导凋亡作用。马钱子及其主要单体马钱子碱在一定剂量时,对不同途径下诱导的软骨细胞凋亡有抑制作用。并在抑制软骨细胞凋亡的同时,对软骨细胞合成代谢功能有一定的改善功能。从而为临床使用通络药马钱子治疗骨关节炎提供了一定的理论依据。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R274.9

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