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《北京中医药大学》 2004年
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羟基红花黄色素A对血管内皮细胞调控机理的研究

张前  
【摘要】:肿瘤的生长需要血管为之提供营养和排除代谢产物。研究表明,至少有30种生长因子与肿瘤的血管生成有关,其中最直接的促血管生成因子是血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。如何阻断肿瘤血管的生成已成为目前肿瘤研究领域的一个重要课题。 抑制肿瘤血管生成药物的筛选依赖于体内或体外的实验方法,体内模型中鸡胚尿囊膜(CAM)生成实验占有优势,是大量初筛抗血管生成药物的良好模型;体外研究模型中一般首先采用噻唑蓝(MTT)实验检测抑制血管内皮细胞生长的药物。 在新血管的发生过程中,血管内皮细胞增殖是最基本和最重要的环节。由于肿瘤细胞和血管内皮细胞互相依赖介导了肿瘤血管新生。因此,研究体外肿瘤血管新生,要求模拟体内与肿瘤细胞共生的过程,即:血管内皮细胞与肿瘤细胞在共培养的条件下生长。 中医理论认为“血瘀证”为肿瘤的基本证型,活血化瘀法在抗肿瘤的研究中占有重要地位。红花是传统的活血化瘀类中药,临床上用于大肠癌等多种恶性肿瘤,但其作用机制鲜见相关报道。羟基红花黄色素A(HSYA)是红花的主要有效成分,目前有关HSYA作用的文章尚篇数不多。对于HSYA抑制新生血管形成的作用,国内外尚未见报道。 本研究通过预实验,首次从十味活血化瘀中药或中药有效组分中,筛选出HSYA能显著抑制CAM新生血管的生成及人脐静脉内皮细胞的增殖。为进一步探讨HSYA对肿瘤细胞的作用情况及作用机理,本研究将肿瘤细胞上清液加入到血管内皮细胞中,建立了异常增殖血管内皮细胞模型,通过MTT实验、荧光定量PCR和ELISA实验观察HSYA对正常及异常增殖血管内皮细胞的作用及作用机理,在基因表达及蛋白表达两个层次上探讨HSYA抑制新生血管可能的作用机理。本实验分为三部分: 第一部分,HSYA影响鸡胚尿囊膜血管生成的机理研究 由于新生血管与bFGF、VEGF及其受体的关系最为密切,本实验设计了bFGF、VEGF及其受体的引物,利用CAM血管生成实验,直接从富含血管的CAM组织上取材,通过RT-PCR实验,观察HSYA对CAM组织中上述三个基因表达的影响。结果表明,HSYA能显著抑制CAM毛细血管中bFGF、VEGF及VEGF受体flt-1的mRNA表达,尤其是对bFGF mRNA的表达明显呈抑制作用,与正常组相比,呈极显著性差异。 第二部分,HSYA在生理及病理条件下对培养ECV304的作用 由于肿瘤血管的生成由血管内皮细胞异常增殖开始的,因此,抑制血管内皮细胞增殖就可以抑制新生血管生成。本实验通过MTT法,观察了不同浓度的HSYA对人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的作用,结果表明,低浓度的HSYA(5.35mg/L~0.16mg/L)表现出有抑制ECV304生长的作用,并且抑制强度与浓度呈反比,当HSYA的浓度在0.66mg/L~0.16m/L之间时,对ECV304细胞的抑制作用最强,呈极显著抑制(p<0.001)。 为了进一步探讨HSYA对肿瘤血管内皮细胞的作用,本实验将肿瘤细胞上清液加入到血管内皮细胞中,建立了异常增殖血管内皮细胞模型,通过MTT实验观察HSYA对内皮细胞的作用。结果表明:不加中药的肿瘤组内皮细胞增长迅速,与对照组比较, 经墓红花黄色素A对血管内皮细胞调控机理的研究 呈极显著促进作用印0.001)。而加入了经基红花黄色素A的中药组,均呈现出不同程 度的抑制作用,尤其是0.66m岁L和0.33mg几两个浓度的HSYA组,与肿瘤组相比显示 出极显著抑制内皮细胞的生长的作用印0.001)。 第三部分经墓红花黄色素A抑制新生血管增殖的机理研究 为了深入探讨HSYA抑制生理及病理情况下内皮细胞增殖的调控机制,本实验设 计了与血管内皮细胞生长有关的数个墓因的引物和数个细胞因子,通过上述建立的正常 与异常增生血管内皮细胞模型,利用荧光定量PCR实验和EUSA实验,从墓因表达及 蛋白表达的两个层次探讨HSYA抑制内皮细胞增殖的可能的作用机理,阐明红花抗肿 瘤的可能的分子机制.结果如下: 荧光定量PCR实验的结果:在共培养细胞模型中,0.“m叭、0.33m叭浓度的HSYA 对血管生成促进因子vEGF及其受体KDR、bFGF及其受体bFGFR和癌墓因c一my。及 硫酸乙酞肝素蛋白聚糖2(HSPGZ/Perlecan)的角RNA表达具有抑制作用;对野生型抑 癌墓因p53 mRNA的表达具促进作用.说明HSYA能抑制新生血管的生成及肿瘤细胞 (L 5180)上清液刺激下血管内皮细胞(E Cv3o4)的增殖,其可能的作用机理之一是由于 HsYA抑制了与增殖相关的早期反应墓因c一myom丑NA的表达,进而抑制了vEGF、 bFGF等生长因子mRNA的表达;之二是HSYA通过促进野生型p53基因的表达,来 抑制VEGF启动子的活性,进而抑制VEGF的表达;之三是HSYA通过在RNA水平上 的调控,降低HSPG的表达,减少了与bFGF的结合,进而减少了bFGF的释放。 EUSA实验的结果:由于Rl;PCR结果只能反应出各基因在RNA水平上的调控情 况,而RNA的表达和蛋白质的表达有时是不一致的,为了更深入地探讨HSYA的作用 机理,本实验检测了VEGF、bFGF等6个与血管内皮细胞生长有关的细胞因子的表达, 进一步在蛋白质水平上探讨HSYA抑制新生血管生成的作用.结果表明:在共培养细 胞模型中,0.“m澎L、o.33m叭浓度的HsYA对血管生成促进因子vEGF及其受体flt一1、 bFGF
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R285

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