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《北京中医药大学》 2004年
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慢性应激肝郁证大鼠模型的复制及相关基因表达的研究

王胜兰  
【摘要】:证候是中医理论的特色之一,它指导着中医临床诊治的实施,并充分体现了 中医整体观、动态变化、个体性等特点,因而成为近年来中医研究的热点。随着 目前现代医学水平的发展,基因组学、蛋白质组学的研究工作已经成为医学中最 为重要的研究方向。疾病的产生多是由于基因、蛋白等功能紊乱造成,且其调控 表达功能与中医理论极为相似,因此,利用基因组学、蛋白质组学技术研究证候 理论是当前一热点的方法。肝郁证是中医肝病的主要证候,是临床常见的证候之 一,具有重要的研究意义。作为一类复杂证候,肝郁证表现不仅涉及肝本身病变, 也关系到全身其它多脏腑系统的复杂病变。它可产生高级神经中枢调节机制紊 乱,涉及到神经、内分泌、循环、消化、免疫、感觉、运动等多系统多方面病理 改变。而目前对肝郁的研究只在某些层面上反映了部分已知基因表达产物(受体、 酶、细胞因子以及肽类等)的改变,远未揭示肝郁证的实质。而证候的复杂表现 应有其物质基础,这种物质基础最终可能是由于基因水平上的调控发生紊乱。基 于上述认识,本文主要从以下方面进行了研究: 1 理论研究 随着后基因组时代的来临,生命科学的研究重点已经从结构基因组学开始转 向功能基因组水平,这种更重视基因功能、更强调相互作用关系和整合的理念, 与中医的学术思想不谋而合。本文从证候出发,阐释了它所具有的整体观、功能 观、动态观、个体化等特色,并研究了其目前存在的问题;同时分析了基因组学、 蛋白质组学目前研究所显示出的特点,进而探讨了运用基因组学、蛋白质组学研 究证候的可行性。证候研究作为中医学发展的重点与核心,面对这种契机和趋势, 已有学者提出证候基因组学、证候蛋白质组学概念。在此基础上,二者相互融合 与渗透而产生的新学科,其深入研究有可能大力推动中医证候学的飞速发展,使 之向一个更深层次迈进。 2 实验研究 实验研究主要从以下两个方面进行: 2.1 肝郁证动物模型的复制。在前期实验结果的基础上,本研究再次利用慢 性温和不可预知应激方法重复了肝郁证动物模型,并进行了 1%蔗糖水摄取量的 行为学和血浆 ACTH 应激激素表达水平的测定。实验进行了 4 次,实验动物均使 用 SD 雄性大鼠,随机分为正常对照组(正常组)、应激模型组(模型组)、应激 模型加阿米替林组(西药组),应激模型加逍遥散组(中药组),采用慢性温和不 可预知应激方法造模。造模第 1 天与第 22 天均测定了各组大鼠 1 小时 1%蔗糖水 摄取量。末次处理的 24 小时后(第 22 天),麻醉大鼠,动脉取血 2ml,抗凝处 理,离心取上清备用。结果显示:实验初期,各组大鼠 1%蔗糖水摄取量经统计 组间无差异,实验第 22 天,模型组 1%蔗糖水摄取量明显低于正常组,中药组与 模型组间无统计学差异,但多次实验均显示数据高于模型组,具有对抗应激的趋 势;血浆 ACTH 结果与 1%蔗糖水摄取量结果较一致,亦显示模型组与正常组组间 WP=5 IV 慢性应激肝郁证大鼠模型的复制及相关基因表达的研究 有统计学意义,模型组血浆 ACTH 高于正常对照组,说明应激导致了动物体内激 素水平的改变。肝郁模型在行为学及神经内分泌学方面重复得到验证。 2.2 通过 Northern 杂交对前期实验分离出的差异显示 cDNA 片段进行了验 证,以发现与肝郁证密切相关的基因表达片段,从而对肝郁证实质和机理进行研 究。造模方法同上,动物造模末次处理后,快速断头处死,冰上取脑,分离海马, 液氮冻存备用。用 Trizol 试剂一步法提取模型大鼠海马总 RNA,并进行甲醛变 性凝胶电泳转膜,将其转至硝酸纤维素膜上固定;另一方面,将前期实验差异扩 增出的 cDNA 片段进行α-32P 同位素标记,与海马总 RNA 进行了 Northern 杂交, 以验证前期实验 DDRT-PCR 结果。本次实验重复了 6、15 和 17 号片段,并又进行 了 2、9、11、12、18 号的杂交验证,8 条差异显示片段在各组间均有表达,但统 计分析组间无显著性差异,即未显示与 DDRT-PCR 相同的结果。 抑郁情绪和异常行为的发生作为肝郁证证候学研究的重要部分,其研究方式 向来重视宏观的行为观察和药效实验,而对于在基因组水平上的本质研究可以说 仍有不少空白,因而无法在根本上阐明肝郁证发生、发展的病理机制。本实验在 前期差异显示扩增(DDRT-PCR)的基础上,用 Northern 杂交验证以期发现与肝 郁证相关的基因表达。实验结果显示 Northern 杂交有表达但无差异,分析可能 为多基因的协同表达在其中起了关键作用。限于时间和经费等因素的制约,上述 结果有待进一步研究验证。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R256.4

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