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《北京中医药大学》 2007年
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枳实降血脂药效组分生物效应评价方法研究

罗容  
【摘要】: 1.研究目的 研究枳实(Fructus Aurantii Immaturus)降血脂药效组分及其生物效应,并与韩国枳实(Fructus Ponciri)比较;建立枳实降血脂药效组分的生物效应评价方法,探讨枳实药效组分生物质量标准,为建立中药药效组分质量标准评价新体系奠定基础。 2.研究方法 采用高效液相色谱法(HPLC)测定枳实降血脂的药效组分,并进行与降血脂相关的生物效应指标分析。 利用高脂饲料和Triton WR-1339诱导SD大鼠造高血脂模型,验证枳实降血脂生物效应。利用HPLC-药效组分生物活性测定结合法,确定枳实降血脂药效组分。选取和高血脂相关的体外生物效应指标研究枳实及其药效组分的降血脂效应,即采用氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)损伤人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)模型,研究枳实及其药效组分对HUVEC细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达和细胞培养液中一氧化氮(NO)含量的影响;采用过氧化氢(H2O2)和叔丁基过氧化氢(t-BOOH)诱导的人肝癌细胞株(HepG2)氧化损伤模型,研究枳实及其药效组分对乳酸脱氢酶(LDH)漏出、丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)、Cu-Zn-超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、过氧化氢酶(CAT)活力影响;利用流式细胞技术,研究枳实及其药效组分对线粒体膜电位(MMP)的影响;利用单细胞凝胶电泳技术,研究枳实对H2O2和t-BOOH诱导的HepG2细胞脱氧核糖核酸(DNA)氧化损伤的保护作用。 3.研究结果 3.1枳实降血脂的药效组分 (1)枳实的药效组分 以药典规定的70%乙醇提取物为标准中药的研究样品,其药效组分为:柚皮苷-橙皮苷-枸橘苷-新橙皮苷-柚皮素-橙皮素(223.66:18.50:254.49:321.00:4.46:1);其中水层部分的药效组分:柚皮苷-橙皮苷-新橙皮苷-柚皮素(178.51:15.18:257.67:1);氯仿层部分的药效组分:橙皮苷-橙皮素-柚皮素(2.92:1:2.99)。 (2)韩国枳实的药效组分 70%乙醇提取物中的药效组分:柚皮苷-橙皮苷-枸橘苷-柚皮素-橙皮素(514.55:16.37:2454.23:20:1);其中水层的药效组分:柚皮苷-橙皮苷-枸橘苷(28.78:1:144.24);氯仿层的药效组分:柚皮素-橙皮素(19.27:1)。 3.2体内降血脂生物效应 3.2.1枳实 能降低高血脂模型SD大鼠血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量、天门冬氨酸转移酶(AST)活性并升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。 对高血脂模型SD大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性和血糖无影响。 3.2.2韩国枳实 能降低高血脂模型SD大鼠血清中的TC、TG和LDL-C含量并升高HDL-C含量。 对高血脂模型SD大鼠血清中ALT活性,AST活性和血糖含量无影响。对于高脂饲料喂养造成的高血脂模型SD大鼠,韩国枳实对其降脂效应比枳实稍好。 3.3枳实及其药效组分体外降血脂生物效应 3.3.1枳实 (1)饮片 ①抑制Ox-LDL损伤HUVEC ICAM-1表达;②恢复Ox-LDL诱导的HUVEC培养液中NO含量至正常水平;③提高H2O2损伤的HepG2细胞活性;④可抑制t-BOOH诱导的HepG2细胞LDH的漏出;提取物氯仿层可抑制H2O2诱导的HepG2细胞LDH的漏出;⑤降低氧化损伤的HepG2细胞中的MDA含量;⑥提高氧化损伤的HepG2细胞的T-AOC;⑦提高t-BOOH诱导的HepG2细胞Cu-Zn-SOD活力;提取物氯仿层可提高H2O2诱导的HepG2细胞Cu-Zn-SOD活力;⑧提高氧化损伤的HepG2细胞GSH-Px活力;⑨提高氧化损伤的HepG2细胞CAT活力;⑩降低氧化损伤的HepG2细胞MMP;○11对氧化损伤的HepG2细胞DNA有保护作用。 (2)药效组分 ①抑制Ox-LDL损伤HUVEC ICAM-1表达;②降低氧化损伤的HepG2细胞中的MDA含量;③提高氧化损伤的HepG2细胞的T-AOC;④提高t-BOOH诱导的HepG2细胞Cu-Zn-SOD活力;⑤提高氧化损伤的HepG2细胞GSH-Px活力;⑥提高氧化损伤的HepG2细胞CAT活力;⑦降低氧化损伤的HepG2细胞MMP。 3.3.2韩国枳实 (1)饮片 对Ox-LDL损伤HUVEC ICAM-1表达,H2O2损伤的HepG2细胞活性,氧化损伤的HepG2细胞中的MDA含量和T-AOC以及GSH-Px活力和CAT活力,t-BOOH诱导的HepG2细胞Cu-Zn-SOD活力,氧化损伤的HepG2细胞MMP的生物活性均和中国枳实饮片的相同。 可以提高Ox-LDL诱导的HUVEC培养液中NO含量但也显著高于正常水平。提取物氯仿层可抑制H2O2和t-BOOH诱导的HepG2细胞LDH的漏出。 (2)药效组分 对Ox-LDL损伤HUVEC ICAM-1表达,氧化损伤的HepG2细胞中的MDA含量和T-AOC以及GSH-Px活力和CAT活力,t-BOOH诱导的HepG2细胞Cu-Zn-SOD活力,氧化损伤的HepG2细胞MMP影响均和中国枳实药效组分的相同。 3.4枳实降血脂质量评价方法建立 (1)生物效应指标:枳实及其药效组分对降血脂相关效应指标的生物效应比(BER)均在0.9~1.1之间并且除了韩国枳实70%乙醇提取物氯仿层药效组分对氧化损伤的HepG2细胞GSH-Px活性影响与韩国枳实70%乙醇提取物氯仿层相比有显著差异(t-test)外,枳实和其相应的药效组分对降血脂相关的效应指标t检验均无显著差异。药效组分的降血脂相关多个指标的标准生物效应作为效应标准,建立了枳实降血脂生物效应评价方法。 (2)药效组分指标:枳实的药效组分为柚皮苷-橙皮苷-枸橘苷-新橙皮苷-柚皮素-橙皮素(223.66:18.50:254.49:321.00:4.46:1)。韩国枳实的药效组分为柚皮苷-橙皮苷-枸橘苷-柚皮素-橙皮素(514.55:16.37:2454.23:20:1)。 4.结论 4.1枳实及其所确定的药效组分降血脂生物效应具有等效性,二者没有显著性差异(t检验)即该药效组分可以表述枳实降血脂临床疗效的品质特征。 4.2枳实生物效应评价方法 (1)降血脂相关的生物活性指标 ①抗氧化指标:H2O2和t-BOOH氧化损伤的HepG2细胞的MDA含量,T-AOC,GSH-Px活力,CAT活力和MMP的变化;t-BOOH氧化损伤的HepG2细胞Cu-Zn-SOD活力。 ②对HUVEC ICAM-1表达的影响。 (2)生物效应评价方法建立 ①抗氧化指标法:枳实对H2O2和t-BOOH氧化损伤的HepG2细胞的MDA含量的BER分别为0.9879和1.0258;对H2O2和t-BOOH氧化损伤的HepG2细胞T-AOC的BER分别为1.00558和0.99777;对H2O2和t-BOOH氧化损伤的HepG2细胞GSH-Px活力的BER分别为1.026和1.044;对H2O2和t-BOOH氧化损伤的HepG2细胞CAT活力的BER分别为0.991和1.023;对H2O2和t-BOOH氧化损伤的HepG2细胞MMP降低的BER分别为0.921743和0.922297;对t-BOOH氧化损伤的HepG2细胞Cu-Zn-SOD活力的BER为1.01546。 ②细胞间黏附分子表达法:枳实对Ox-LDL诱导的HUVEC的ICAM-1的表达抑制的BER为0.9781。 枳实及其药效组分的降血脂相关生物活性指标的BER在0.9~1.1之间并且枳实与其药效组分的生物效应无显著差异。故可确定枳实药效组分的标准生物效应作为效应标准。 4.3枳实降血脂药效组分 降血脂药效组分能够做为枳实的质量评价指标之一。 4.4枳实降血脂质量标准建议 4.4.1抗氧化指标法和细胞间黏附分子表达法 ①用与药效组分完全相同的生物效应测定方法检测待测枳实生物效应。 ②计算BER并做相关数理统计检验。 ③生物效应评价方法标准建议: 1≥BERS≥0.9且经数理学比较与效应标准无差异,为合格药品; BERS1且经数理学比较与效应标准无差异为优质药品; BERS0.9或经数理学比较与效应标准有差异为不合格药品; 4.4.2药效组分分析 采用HPLC法。 待测样品枳实所得药效组分比例和含量应在以柚皮苷-橙皮苷-枸橘苷-新橙皮苷-柚皮素-橙皮素(223.66:18.50:254.49:321.00:4.46:1)为基准的一个范围内。 5.创新点 (1)首次研究了枳实和韩国枳实降血脂(血浊证)的生物效应。 (2)确定了枳实降血脂的药效组分。 (3)建立了枳实药效组分生物效应评价方法。 (4)创立了生物效应比的计算公式:BERsample=Xsample/XACA。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R284

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中国重要报纸全文数据库 前10条
1 青海省中医院 伏新顺;枳实常用药对2则[N];中国中医药报;2010年
2 青海省中医院 伏新顺;枳实常用药对二则[N];中国中医药报;2010年
3 张中桥;CBP技术可减轻MODS患者的氧化损伤[N];中国医药报;2007年
4 陕西中医学院附属医院脾胃病科 王捷虹;半夏黄连配枳实消痞满[N];中国中医药报;2010年
5 ;氯离子通道阻断剂对肺血管内皮细胞氧化损伤的保护作用[N];中国医药报;2003年
6 赵辉;湘产药材 走势各异[N];中国医药报;2001年
7 保健时报特约记者 曾佑忠;SOD抹在脸上很难抗氧化[N];保健时报;2007年
8 金海;抗氧化剂在眼病防治上获进展[N];中国中医药报;2009年
9 刘云涛;青岛大学研究发现:海洋生物活性成分可抑制紫外线损伤皮肤[N];中国医药报;2007年
10 常克;心痒汤[N];中国中医药报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 罗容;枳实降血脂药效组分生物效应评价方法研究[D];北京中医药大学;2007年
2 张敬;镍化合物诱导肺癌发生的分子机理的研究[D];第二军医大学;2006年
3 胡劲涛;氧化损伤在低出生体重仔鼠发生代谢综合征过程中的作用及干预研究[D];中南大学;2008年
4 许商成;职业有害因素暴露致神经细胞线粒体氧化损伤及防护策略探讨[D];第三军医大学;2010年
5 聂静;衔接蛋白p66Shc对糖尿病肾病肾小管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响与机制研究[D];中南大学;2009年
6 于丽红;急性脑梗塞患病人群入院前血浊证的流行病学研究[D];山东中医药大学;2008年
7 许爱华;枳实、枳壳的应用及配伍规律研究[D];南京中医药大学;2009年
8 肖骏;Eales病人血液中氧化及抗氧化水平分析[D];吉林大学;2006年
9 赵颖;促红细胞生成素对人视网膜色素上皮细胞保护作用的研究[D];青岛大学;2006年
10 奚苗苗;中药皂苷的抗糖尿病活性筛选和药效学研究[D];第四军医大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈瑾;血清T-SOD、GSH-Px、MDA、NO、NOS水平与衰老的关系及康寿益胶囊的干预作用[D];重庆医科大学;2003年
2 陈宏;盐霉素、阿散酸对小鼠机体的氧化损伤及生殖毒性的研究[D];南京农业大学;2005年
3 刘莉莉;奶山羊乳房炎的氧化损伤及其机理[D];东北农业大学;2007年
4 肖紫云;褪黑色素对人视网膜色素上皮细胞氧化损伤保护作用的研究[D];福建医科大学;2008年
5 周书川;α-硫辛酸对氧化损伤大鼠肝细胞糖代谢关键酶的影响及其机制的研究[D];天津医科大学;2010年
6 李凡;青、老年鼠心肌细胞缺血再灌注后氧化、抗氧化损伤指标及凋亡相关因子的变化[D];中国医科大学;2005年
7 周红伟;阿魏酸钠对慢性脑缺血大鼠氧化损伤的神经保护作用[D];武汉大学;2005年
8 郭亮;静脉注射~(53)Cr标记吡啶甲酸铬对仔猪细胞DNA及氧化的影响[D];中国农业科学院;2008年
9 关坤;镉致大鼠肝线粒体氧化损伤及NAC干预作用的实验研究[D];中国医科大学;2009年
10 殷英霞;雌、雄激素对去卵巢雌鼠晶状体氧化损伤影响的实验研究[D];河北医科大学;2010年
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