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《北京中医药大学》 2007年
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脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生的影响

刘敬霞  
【摘要】: 背景与目的 缺血性脑血管疾病的高致残率严重影响患者的生存质量,脑缺血损伤引起的神经元结构破坏和缺失是引起功能障碍的病理关键。针对脑缺血损伤引起的生化、代谢改变,保护神经元免于受损,或促进脑缺血损伤后神经细胞再生成为干预损伤、恢复功能的重要策略。目前药物性的神经保护研究和临床应用仍欠理想。骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)具有较强的增殖能力和多向分化潜能,可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经细胞,成为脑缺血损伤后神经细胞再生理想的种子来源。鉴于骨髓间充质干细胞体外诱导剂的毒副作用和体外分化后移植脑内较弱的存活能力,近年来,对体外纯化、扩增培养的骨髓间充质干细胞移植脑内以治疗脑缺血损伤成为研究的热点。因此,开展骨髓间充质干细胞移植在神经细胞再生和神经功能修复方面的研究对脑缺血损伤具有重要意义。近年来渐有中医药在骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤的报道,但研究多集中于对其体外的诱导分化方面,所选药物以单味中药或提取物为主,而中药复方对BMSCs移植后在活体内影响其存活、分化方面的研究少见。脑梗死属中医“中风”范畴,其病机复杂,以浊毒、血瘀和气虚表现尤为突出:气虚血瘀、毒损脑络为脑梗死的主要病机。解毒降浊、益气化瘀为脑梗死的主要治法。据此研制的中药复方脑脉通(大黄川芎人参葛根)具有解毒降浊、益气活血通络功效,可对脑缺血损伤发挥保护作用。动物实验和临床观察表明,脑脉通治疗脑梗死的效果肯定,可显著改善患者的生存质量。鉴于上述,开展中医药联合骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤研究具有重要意义。本研究从脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生方面评价脑脉通、BMSCs移植及其联合的脑保护作用,并从脑脉通对BMSCs移植后脑组织神经营养因子水平、向神经细胞分化的比率及对促神经元突触重建的生长相关蛋白表达的影响方面探讨其可能的作用机制。 方法 本研究以SD大鼠为研究对象,体外全骨髓贴壁筛选培养法获取骨髓间充质干细胞;移植前48 h用Brdu对骨髓间充质干细胞进行体外标记;栓线阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血再灌注动物模型;脑缺血3 h再灌注24 h由颈内动脉移植骨髓间充质干细胞悬液。动态观察移植后早期(7 d)、中期(14 d)、后期(28 d)大鼠的神经功能和生存状况变化;采用病理形态学、免疫组织化学法以及免疫组织化学双标法,从神经功能综合评分、脑组织含水量、脑梗塞灶、神经细胞超微结构变化方面观察脑脉通对骨髓间充质干细胞移植保护脑缺血损伤的影响;从神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白以及与之相关的神经营养因子表达的变化方面探讨脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对神经细胞的保护作用及可能的作用机制;观察骨髓间充质干细胞移植后在脑内的存活、迁移和分化特点以及脑脉通对其的影响;进一步从神经元突触标志性蛋白表达的变化方面观察骨髓间充质干细胞移植后对神经元突触重建的作用以及脑脉通对其作用的影响。主要研究结果如下: 结果 1.脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 1.1体外全骨髓贴壁筛选培养法纯化骨髓的效果理想,可在短期内获取移植所需的骨髓间充质干细胞;颈动脉移植骨髓间充质干细胞操作易行,细胞悬液少有外漏,移植途径可取。 1.2脑缺血再灌注损伤后大鼠体重变化呈现由减轻到增加的趋势,且体重的变化与大鼠全身状况一致;大鼠神经功能随脑缺血再灌注时间的延长逐渐恢复;脑组织水肿程度、梗塞灶的大小及神经细胞超微结构的改变随脑缺血再灌注时间的延长出现由加重到减轻的改变。 1.3骨髓间充质干细胞由颈内动脉移植对脑缺血损伤的保护作用与其移植脑内后的时间相关,BMSCs移植后早期未显出明显的保护作用;移植中期的神经功能恢复,脑组织水肿、梗塞灶大小和神经细胞超微结构有改善趋势;移植后期的神经功能恢复和神经细胞超微结构的改善明显。 1.4脑脉通对脑缺血再灌注损伤不同时间的均有不同程度的改善作用;BMSCs移植联合脑脉通对脑缺血再灌注损伤的保护作用较单纯BMSCs移植的作用提前,联合应用对神经功能的修复和对神经细胞病理损伤的改善作用明显增强,且随移植后BMSCs在脑内时间的延长,联合应用的保护作用更为显著。 2脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞再生及神经营养因子的影响 2.1随着脑缺血再灌注时间的延长,脑组织神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白的表达减弱;神经生长因子和胶质源性神经营养因子的变化随脑缺血再灌注时间的延长呈现先增高再降低特点。 2.2 BMSCs移植后早期神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白无明显增高;随BMSCs移植脑内时间的延长,神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白的表达增强,其中神经元特异性烯醇化酶的增强较胶质纤维酸性蛋白明显,以移植后期的增强更为显著。BMSCs移植后早期对神经生长因子和胶质源性神经营养因子的水平变化无明显影响,随移植后时间的延长,其上调神经营养因子的作用增强。 2.3脑脉通联合BMSCs移植后早期神经元特异性烯醇化酶的表达较单纯移植组增强;联合组后期的神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达均有增强。脑脉通联合BMSCs可明显提高移植中期胶质源性神经营养因子水平,并使移植后期神经生长因子的表达明显增强。 3.脑脉通对脑缺血再灌注损伤大鼠骨髓间充质干细胞移植后向神经细胞分化的影响 3.1 BMSCs移植后在脑实质内和血管腔内的分布比例随移植后时间的延长而增加。移植后早期,大多BMSCs位于血管腔内,黏附血管内皮呈丛簇样聚集,脑实质内有少量散在的BMSCs,分布未见明显规律;移植后中期,BMSCs大多从血管壁通过血脑屏障进入脑实质内,并向缺血侧部位迁移,血管腔内可见到少数标记的BMSCs;移植后期,血管腔内未见Brdu细胞,存活的BMSCs全部由血管进入脑实质,并迁移至缺血侧,对侧少有Brdu细胞;联合脑脉通可使OBMSCs移植后在脑实质内存活的数量明显增多,但脑实质和血管腔内BMSCs的比例及进入脑实质后的迁移方向未见明显改变。 3.2 BMSCs移植后向神经细胞的分化随植入时间的延长出现分化率和分化方向的改变。BMSCs移植后早期在脑实质内的分化率低,未显示出分化方向的差异性;移植后中期的分化率明显增高,以向神经胶质细胞的分化明显;移植后期,BMSCs向神经元细胞的分化明显增强,而向神经胶质细胞的分化相对减弱;脑脉通对BMSCs移植后不同阶段在促进BMSCs向神经细胞分化方面的作用具有差异性,表现为在移植中期促进神经胶质细胞分化,而移植后期则使BMSCs向神经元方向的分化增强。 4.脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元突触重建的影响 4.1脑缺血再灌注损伤后神经元结构破坏,神经丝排列紊乱,变短,数量减少,稀疏,分布不均匀,且随脑缺血再灌注时间的延长而加重;促进受损后神经元突触重建的生长相关蛋白-43和标志神经元突触重建的蛋白表达减弱,且随脑缺血再灌注时间的延长呈现递减趋势。脑脉通对脑缺血再灌注早期的神经元结构受损具有保护作用,神经元突触素蛋白的表达增强,但对生长相关蛋白-43的表达无显著影响。 4.2 BMSCs移植后早期对神经元结构受损未显出明显的保护作用;移植后中期,神经元突触重建特异性标志蛋白显示增加趋势;移植后期神经丝蛋白、促突触重建的生长相关蛋白-43和神经元突触素蛋白的表达增强。BMSCs对脑缺血再灌注损伤神经元突触重建的促进作用与移植脑内存活的时间相关,该作用随移植后时间的延长而增强。 4.3脑脉通联合BMSCs移植可使早期神经丝蛋白表达增强、神经元结构破坏减轻;神经生长相关蛋白-43的表达提前,并增强其后期的表达;移植后期神经元突触素蛋白的表达增强。 结论 综合上述研究,结果提示,①体外全骨髓贴壁筛选纯化、培养和扩增BMSCs的方法可行,Brdu标记BMSCs的效果理想,由颈内动脉移植BMSCs悬液易于操作,移植后的BMSCs可在脑内存活、迁移,对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。②脑缺血再灌注损伤后神经功能、脑组织水肿、梗塞灶大小和神经细胞超微结构改变可随脑缺血再灌注时间延长有不同程度恢复;脑脉通对脑缺血再灌注损伤不同阶段具有不同程度的保护作用,以早期的作用明显;BMSCs对脑缺血再灌注损伤的保护作用与其移植后的时间相关,移植后早期未显出明显的脑保护作用,但随着BMSCs移植脑内时间的延长,其保护作用逐渐增强。③神经细胞随脑缺血再灌注损伤时间的延长持续受损、数量减少,神经营养因子出现先增高再降低特点,其在早期的升高对神经细胞受损具有保护作用,后期水平降低则不利于神经细胞的再生和修复;脑脉通对神经细胞的保护作用与其早期和中期上调胶质源性神经营养因子、后期上调神经生长因子表达有关;BMSCs移植对保护神经细胞和上调神经营养因子表达的作用随移植后时间的延长而增强;脑脉通联合BMSCs移植可使其对神经细胞的保护作用提前,并使后期的作用增强,以对神经元的作用尤为明显,这可能与脑脉通促进BMSCs移植后上调神经营养因子表达的作用有关。④随移植后时间的延长,BMSCs逐渐从血管壁通过血脑屏障进入脑实质内存活、向缺血侧迁移,出现神经细胞分化,但未显示出分化方向的差异性;脑脉通可使移植后BMSCs在脑内的存活增强,并在促进其向神经细胞分化方面显示出差异性,表现为促进中期BMSCs向神经胶质细胞分化和后期向神经元细胞分化。⑤神经元突触重塑是其结构重建与功能修复的基础,神经元突触重塑功能随脑缺血再灌注时间的延长有减弱趋势,这可能与促进神经元突触重建生长相关蛋白的表达下调有关;脑脉通在脑缺血再灌注早期可保护神经元结构受损,后期可增强神经元突触重建;BMSCs对神经元突触重建作用随移植后时间的延长逐渐增强;脑脉通联合BMSCs可使脑缺血再灌注损伤后早期神经元突触重建提前,并可增强中期与后期的神经元突触重建,其作用可能是通过上调促神经元突触重建的生长相关蛋白-43的表达实现。因此认为,脑脉通联合BMSCs移植对脑缺血再灌注神经细胞再生具有促进作用,其作用与脑脉通使BMSCs移植后上调神经营养因子、促进向神经细胞分化及增强促神经元突触重建的生长相关蛋白表达的作用在早期提前和在后期增强有关。研究可为BMSCs移植治疗脑缺血损伤以及相关领域中药的深入研究提供科学依据,并对进一步中医药学及其与细胞治疗学应用的研究具有重要价值。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5;R743

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3 兰希发;大鼠脑缺血再灌注后脑水肿与水孔蛋白4表达关系的研究[D];中国医科大学;2004年
4 李大伟;白花丹参对大鼠脑缺血再灌注后神经再生的影响[D];泰山医学院;2012年
5 耿倩;康脑液对脑缺血再灌注大鼠内源性神经干细胞增殖、分化影响的研究[D];河北北方学院;2012年
6 刘旭;粘附分子在脑缺血再灌注不同时期的表达及与炎症反应关系的研究[D];天津医科大学;2008年
7 韩旭;复方当归注射液对脑缺血再灌注后炎症反应的保护作用及其机制的实验研究[D];四川大学;2005年
8 姜炎;易达拉奉对大鼠脑缺血再灌注后核因子κB及半胱天冬酶-3的影响[D];郑州大学;2006年
9 张富文;中药视明注射液对脑缺血再灌注大鼠脑神经细胞影响的实验研究[D];成都中医药大学;2002年
10 侯铁军;丁苯酞对脑缺血再灌注小鼠内源性神经干细胞增殖作用影响的研究[D];天津医科大学;2007年
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