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《北京中医药大学》 2009年
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毒热平注射液抗流感病毒作用及免疫调控机制的实验研究

曾郁敏  
【摘要】: 实验目的: 流感是流感病毒引起的急性呼吸道传染病,好发于冬、春季节。尤其是甲型流感病毒,由于其极易产生变异,制备有效的疫苗困难重重,而针对流感病毒感染的西药既有较强的毒副作用,又容易诱导病毒产生耐药性。这种现状下,在我国的中医药宝库中寻找有效药物、创造新型药剂来防治流感就成为一项很有意义的研究工作。 毒热平注射液是由黄芩、栀子、灯盏花、猪胆粉等四味药物组成的中药复方制剂,根据中医理论“毒损肺络”病机理论配伍研制而成,具有清热燥湿、凉血解毒、活血通络的功效。本实验采用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM_1)感染小鼠作为模型,观察毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠的抗病毒作用及其对免疫功能的影响,以天然免疫中重要的模式识别受体Toll样受体为切入点,探讨其抗病毒作用及免疫调节作用的分子机制,为毒热平注射液的临床应用提供理论依据。 实验方法: 1.毒热平注射液对FM_1感染小鼠死亡保护率的影响 将ICR小鼠随机分为七组:正常组、模型组、利巴韦林组、双黄连组、毒热平注射液大、中、小剂量组,以4LD50的流感病毒液滴鼻感染小鼠造模,0.05mL/只,正常组以生理盐水滴鼻对照。造模后当日腹腔注射给药,每天1次,连续7天;正常组和模型组小鼠注射生理盐水对照。自造模当日起连续观察14天,计算各组死亡率及平均生活日。 2.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响 将ICR小鼠随机分为七组:正常组、模型组、利巴韦林组、痰热清组、毒热平注射液大、中、小剂量组,以4LD50的流感病毒液滴鼻感染小鼠造模,0.05mL/只,正常组以生理盐水滴鼻对照。造模后当日腹腔注射给药,每天1次;正常组和模型组小鼠注射生理盐水对照。按照要求在不同时间点处死小鼠,摘取肺脏,计算肺指数,同时各组取肺组织分别进行固定和匀浆,作病理形态学检测和肺组织中病毒滴度的检测。 3.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠免疫功能的影响 动物分组、造模、给药方法同上。按照要求在不同时间点处死小鼠,无菌取脾脏做脾脏T、B淋巴细胞增殖活性的检测,采用MTT法;摘取小鼠肺脏进行匀浆,和小鼠血清一起用ELISA试剂盒检测炎症因子TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-4、IL-12以及趋化因子IL-8、MIP-2、RANTES、IP-10等的含量。 4.毒热平注射液对FM1病毒感染小鼠免疫调控分子机制的研究 动物分组、造模、给药方法同上。按照要求在不同时间点处死小鼠,冰浴条件下无菌迅速摘取小鼠肺脏,置于无RNase EP管中,立即投入液氮中冷冻。每组取5个肺组织。用PCR法检测肺组织中TLR3及PKR mRNA的表达,用Western-blot法检测TLR3及PKR蛋白的表达。 实验结果: 1.毒热平注射液对FM_1感染小鼠死亡保护率的影响 模型组的死亡率为75%,平均生存时间为8.69d。毒热平注射液中剂量组死亡率为36.3%,与模型组比较,经x~2检验差异显著,P<0.05;毒热平注射液大剂量组平均生存时间为10.8d,与模型组比较P<0.05;毒热平中剂量组平均生存时间为11.81d,与模型组比较P<0.01。 2.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响 2.1在不同时间点观察受试动物,可见正常组小鼠体重稳步上升,模型组小鼠的体重在三个时间点表现出先增加再下降的趋势,且均显著低于正常组。用药组中,利巴韦林组体重逐渐增加,痰热清组及毒热平各剂量组趋势同模型组。在每个时间点上,造模72h后,与模型组比较,发现毒热平中剂量组有明显差异,P<0.05;造模120h后,毒热平小、中剂量组与模型组比较有明显差异,P<0.05或P<0.01。 2.2在不同时间点观察受试动物,可见模型组及各用药组的肺指数均呈现逐步升高的趋势。在每个时间点上,造模72h后,与模型组比较,利巴韦林组肺指数有显著性差异,P<0.01;毒热平中、大剂量组有明显差异,P<0.05;造模120h后,与模型组比较,发现利巴韦林组肺指数有极为显著性差异,P<0.001;毒热平中剂量组有明显差异,P<0.05。 2.3在不同时间点观察受试动物,可见模型组及各用药组肺组织中病毒滴度呈现逐步上升的趋势。感染120h后,与模型组相比,利巴韦林对肺脏中的病毒杀伤效果最明显,P<0.001;毒热平注射液中剂量组对肺脏中的病毒亦有明显杀伤作用,P<0.01,其余用药组与模型组比较无差异。 2.4 HE染色光镜观察正常组小鼠肺泡结构完整清晰,腔内未见渗出。模型组造模24h可见弥漫性肺泡壁增厚,肺泡壁血管扩张充血,有少量单个核细胞浸润,部分肺泡有少量出血。造模72h后可见弥漫性肺泡壁增厚,部分区域较前次显著增厚,有明显单个核细胞浸润。造模120h后可见支气管管腔内有出血及炎性渗出,支气管周围有多量淋巴细胞浸润;弥漫性肺泡壁增厚,局灶性肺泡实变。各用药组病变明显减轻,但随时间变化而病变均逐渐加重。利巴韦林120h组仍只见轻度病变;痰热清组、毒热平大、中、小剂量组病变均呈进行性加重,但均轻于同时期模型组。 3.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠免疫功能的影响 3.1不同时间点观察受试动物,可见模型组脾脏T、B淋巴细胞增殖活性随时间变化呈现逐渐下降的趋势,造模后小鼠的T细胞增殖活性比B细胞增殖活性抑制更为明显。在三个时间点,模型组T细胞的增殖活性均明显受抑,P<0.001,各用药组对其均有不同程度的恢复;造模24h后可见除利巴韦林组外的各中药组还表现出免疫促进的作用,与正常组相比显著增高,P<0.001。造模72h后和120h,各用药组对小鼠的免疫抑制也有了不同程度的恢复,与模型组相比P<0.001~P<0.05,但均未恢复到正常组水平。各组B细胞增殖活性变化与T细胞近似,但变化程度较为缓和。 3.2不同时间点检测各组动物血清及肺匀浆中的细胞因子,可见模型组除IL-4水平随时间变化逐渐降低外,TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-12以及趋化因子IL-8、MIP-2、RANTES、IP-10均呈现逐渐升高的趋势。各用药组对其有不同程度的干预作用。总体来说,相比而言,对各细胞因子的干预效果,痰热清组>利巴韦林组>毒热平大剂量组>毒热平中剂量组,毒热平小剂量组一般来说效果较差。 4.毒热平注射液对FM1病毒感染小鼠免疫调控分子机制的研究 与正常组相比,模型组小鼠不同时相感染FM1后对肺组织中TLR3及PKR mRNA及蛋白的表达水平造成了不同程度的增高,药物亦发挥了不同程度的干预作用。总体而言,TLR3及PKR mRNA及蛋白的表达水平随时间变化呈现先升高(72h)、后下降(120h)的趋势,除毒热平小剂量组外,其他各用药组均可抑制其升高的水平,与模型组相比,P<0.01或P<0.05,但均不能恢复到正常组水平。 结论 1.毒热平注射液具有抗病毒作用 通过观察药物对肺脏中病毒滴度的影响发现,毒热平注射液中剂量组可明显抑制肺脏中病毒的增殖,具有一定的抗病毒作用。 2.毒热平注射液对FM_1感染小鼠的死亡和肺组织损伤具有保护和改善作用: 毒热平注射液中剂量组可明显降低FM1感染小鼠的死亡率,降低肺指数,改善肺脏病理变化,对FM_1感染小鼠的死亡和病毒引起的肺组织损伤具有保护作用。 3.毒热平注射液对FM_1感染小鼠免疫功能具有调节作用: 3.1流感病毒FM_1感染小鼠后,对脾脏T、B淋巴细胞的增殖活性具有明显的抑制作用,而毒热平注射液可对其有明显的恢复作用。 3.2毒热平注射液对FM_1感染小鼠血清及肺组织匀浆中细胞因子水平具有调节作用,可显著升高因病毒感染引起的IL-4下调以及抑制其他细胞因子和趋化因子的上调,减轻炎性病理损伤,进而恢复机体免疫功能的稳定和平衡,并帮助机体抵御病毒的侵害作用。 4.毒热平注射液可通过调节肺组织中TLR3和PKR的表达水平来发挥免疫调节作用。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R285.5

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