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《北京中医药大学》 2010年
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电针对APP转基因鼠脑Aβ水平及脑微血管病变影响的研究

薛卫国  
【摘要】: 阿尔茨海默病(AD)是以记忆力减退、认知功能障碍为特征的渐进性中枢神经系统退行性疾病。由于其发病机制尚不完全明了,迄今也无肯定而有效的治疗措施,其相关研究已成为国内外医学研究的重点课题之一。AD的主要病理特征为脑神经细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)沉积所形成的老年斑(SP)、神经细胞内的神经原纤维缠结(NFTs)、神经细胞及突触脱失以及脑血管淀粉样变(CAA)等。Aβ假说是目前公认度最高的AD发病机制学说,该学说认为脑内Aβ聚集及其神经毒性造成其一系列病理变化及临床表现;由于Aβ产生与清除失衡而导致脑内Aβ水平的增高。近年来,针对脑微血管Aβ清除途径的研究已成为探讨AD发病机制、选择治疗靶点的热点。 中医认为AD病位在脑,与肾密切相关;病性属本虚表实,肾精亏虚致髓海不足,脑失充养;痰瘀浊毒阻络,蒙蔽脑窍。针刺可通经络、活气血,“百会、涌泉”配伍既可祛瘀通络化浊、开窍醒神,又可补肾填髓。针刺有可能通过对脑络——脑微血管的结构与功能的调节对脑内Aβ的清除产生影响,降低脑Aβ水平,减少Aβ毒性作用。为此,我们以针刺对脑内Aβ水平、对脑微血管结构及Aβ清除转运受体LRP1等的影响作为研究靶点,探讨揭示针刺治疗AD的相关作用机制。 实验目的: 通过观察脑内Aβ分布部位及水平、脑微血管壁结构变化及Aβ血脑屏障主动转运受体LRP1的表达水平,探索APP转基因鼠脑内Aβ水平升高的机制;同时观察电针对脑内Aβ水平及微血管病理变化的影响,探讨电针能否影响脑内Aβ水平,其机制是否与Aβ血管清除途径有关,为AD“毒阻脑络”理论及针刺“通络祛毒”理论提供实验依据。 实验方法: 本实验以13月龄APP695V717I转基因鼠为AD动物模型,将12只APP转基因鼠随机分入模型组(M)和电针治疗组(EA),每组6只;以6只同龄C57BL/6鼠为正常对照组(C)。电针治疗组针刺“百会”、“涌泉”穴3个月,模型组、正常对照组除不针刺外,其它处理与电针治疗组相同。采用LashleyⅢ水迷宫、Y-电迷宫测试APP转基因鼠的学习记忆行为学变化及电针影响;采用免疫组织化学(IH)、ThioflavinS染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质免疫印记分析(WB)、透射电镜(EM)等技术和方法,观察脑内Aβ阳性表达部位及水平、Aβ清除转运受体LRP1阳性表达部位及水平,观察脑微血管Aβ沉积情况、超微结构变化及电针对其影响。 实验结果: 1) LashleyⅢ水迷宫测试结果显示,16月龄APP转基因鼠水迷宫游出时间、进入盲端次数皆多于正常对照组(P0.05),而电针治疗组水迷宫游出时间、进入盲端次数皆少于模型组(P0.05);Y-电迷宫测试显示,16月龄APP转基因鼠达标所需训练次数多于正常对照组(P0.05),而电针治疗组达标所需训练次数少于模型组(P0.05)。提示APP转基因鼠存在学习记忆行为学障碍,电针可有效改善APP转基因鼠的学习记忆能力。 2)电镜超微结构(EM)显示,APP转基因鼠大脑皮层神经元出现明显变性,部分神经元颜色转暗,变形、萎缩,胞体及突起出现大量次级溶酶体,溶酶体内有大量囊胞样结构;脑微血管内皮细胞变薄,局部基底膜增厚,轮廓不清,基底膜外可见高电子密度物质,星形胶质细胞足突肿胀,内容物减少;而电针可在一定程度上改善APP转基因鼠的这些超微结构病理变化。 3)免疫组织化学方法(IH)显示,Aβ表达于神经元胞浆及突起,Aβ1-40表达于大部分神经细胞,而Aβ1-42仅表达于部分神经细胞;APP转基因鼠皮层Aβ1-40、Aβ1-42阳性表达积分光密度(IOD)皆强于正常对照组(P0.05,P0.01);而电针治疗组皮层Aβ1-40、Aβ1-42表达弱于模型组(P0.05,P0.01)。脑微血管壁仅呈Aβ1-42阳性表达,ThioflavinS染色证实为脑血管淀粉样沉积,APP转基因鼠海马微血管壁Aβ1-42阳性表达强于正常对照组(P0.01);电针组海马微血管壁Aβ1-42阳性表达弱于模型组(P0.05)。免疫组织化学方法还显示,APP转基因鼠皮层及海马微血管Aβ转运受体LRP1阳性表达弱于正常对照组(P0.01,P0.01);电针治疗组皮层及海马微血管LRP1阳性表达强于模型组(P0.05,P0.05)。 4)酶联免疫吸附测定(ELISA)显示,APP转基因鼠脑组织Aβ1-42水平高于正常对照组(P0.01);电针治疗组脑组织Aβ1-42水平低于模型组(P0.01)。结合免疫组化结果,提示电针可降低APP转基因鼠皮层Aβ1-40、A p 1-42免疫组化阳性表达,降低海马微血管Aβ1-42免疫组化阳性表达,降低脑内Aβ1-42水平。ELISA检测还显示,电针可降低APP转基因鼠脑脊液、血清Aβ1-42浓度(P0.01,P0.01)。 5)蛋白质免疫印记分析(Western Blot)显示,APP转基因鼠脑组织匀浆LRP1水平明显低于正常对照组,而电针治疗组脑组织匀浆LRP1水平高于模型组。结合免疫组化结果,提示电针可增强APP转基因鼠皮层及海马微血管LRP1免疫组化阳性表达,增强APP转基因鼠脑组织匀浆LRP1水平。 结论: 1.脑神经细胞内Aβ产生增加、血管途径Aβ清除功能减退可能是APP转基因鼠脑组织Aβ水平升高、出现学习记忆功能障碍的主要机制。 2.电针可改善APP转基因鼠的学习记忆行为学障碍,其机制可能是通过影响Aβ的产生及清除而降低脑内Aβ水平,从而减轻了其神经毒性作用。 3.电针可能通过影响APP转基因鼠脑神经元紊乱的自我吞噬机制,减少细胞内Aβ的产生;通过提高脑微血管LRP1介导的Aβ血脑屏障主动转运,减少脑微血管壁Aβ的沉积及脑组织Aβ水平。 4.改善脑微血管结构与功能,提高脑微血管Aβ清除能力,减少脑微血管壁Aβ沉积,可能是电针降低脑Aβ水平的主要机制之一。为针刺“通络祛毒”治疗AD提供了实验依据。 本课题首次利用APP转基因鼠研究了针刺治疗AD的机制。我们发现,APP695V717I转基因鼠的脑微血管壁出现了淀粉样沉积,且脑微血管淀粉样沉积早于典型淀粉样斑块的形成,微血管淀粉样沉积的主要成分为Aβ1-42。在国内尚未见报道。
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R245

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