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《首都师范大学》 2001年
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转基因植物生产生物可降解塑料PHB的研究——napinB启动子的分离和功能鉴定及转基因油菜获得

李丽  
【摘要】: 聚-β-羟基链烷酸(PHA)是许多微生物作为碳源、能源的一类贮藏性聚酯, 具有广泛应用价值。该聚酯具有与合成塑料相似的性质并可被微生物完全降解,研 究PHA在植物中合成并提高其含量可为解决环境污染提供新途径。 聚-β-羟基丁酸酯(PHB)为分布广泛、研究最早、研究较为清楚的PHAs。前 期工作已通过聚合酶链式反应扩增并克隆了罗氏真养菌(Ralstonia eutrophus)中PHB 合成三个关键酶基因——phbA(编码3-酮硫裂解酶)、phbB(编码乙酰乙酰CoA还原 酶)、phbC(编码PHB合酶),并分离种子特异性启动子(7S promoter)和质体导肽序 列(ctp),利用已克隆的三个基因,分别构建含种子特异性启动子的嵌合phbC、phbB 的二价表达载体pSCB及嵌合phbC、phbA、phbB的三价表达载体pSCAB,并由导 肽将基因产物定位质体。经根癌农杆菌介导转化油菜(Brassica napus L.)H165,分 子检测表明,已获分别整合三个基因且在转录水平表达的转基因植株。 上述表达框架中三个酶基因均采用相同启动子和导肽序列,较多同源序列会增 加基因沉默的可能性,我们拟从油菜品系H165中分离新的启动子(napinB promoter),优化现有表达框架。NAPIN是由基因家族编码的油菜(Brassica napus) 种子贮存蛋白,napinB基因已经分离和鉴定。Radke(1988)等人已证明翻译起始 密码子前300bp序列就足以启动下游嵌合基因在转基因油菜中相应发育阶段正确表 达。根据引物设计原则和已知DNA序列,设计并合成特异性引物,通过PCR技术从 油菜(H165)基因组DNA中扩增到一条约300bp的带。测序结果与napinB启动子比 较显示,同源性达97%以上。除TACACAT框内一个碱基由A变为T、B-box中两个碱 基突变之外,其余调控序列完全吻合;非保守区有5个碱基不同源,三处因引入了 酶切位点,另两个非同源碱基推测可能该启动子在不同油菜品系间差异所致。以上 结果分析表明,nap300可启动外源基因的种子特异性表达。我们将扩增到的片段分 别与gus和phbA基因相连,构建鉴定其功能的表达框架。经冻融法转化农杆菌 摘 要 LBA4404,并通过叶盘法分别对烟草(Nlcotjma tabac伽 cv.Wisconsin38)进行转化, PCR和 PCR-Southern结果表明我们已获转基因植株,取其种子做 GUS和卜酮硫裂解 酶活性分析,因烟草生长周期较长,目前鉴定工作还在进行中。我们将用其替换原 二价和三价表达框架中相同的7S启动子,以期获得高PHB表达量的转基因植株;同 时,利用己有的三种种子特异性表达载体继续油菜三系转化工作,已获分别整合相 应基因的转基因油菜植株,为田间杂交工作提供更多的试材,为早日实现PHB商品 化生产提供理论依据。
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