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小麦近缘种谷蛋白新亚基鉴定与编码基因克隆及其分子进化分析

安学丽  
【摘要】:小麦谷蛋白是贮藏蛋白中的主要成分,由高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)两部分组成。HMW-GS与LMW-GS的含量及组成可直接影响小麦面粉的加工和烘烤品质。研究显示,粗山羊草(Aegilops tauschii,DD,2n=2x=14)的Glu-1D~t位点编码的HMW-GS变异类型丰富,且大多为普通小麦中尚未发现的新类型。栽培一粒小麦(Triticum monococcum L.,A~mA~m,2n=2x=14)的Glu-1A~m位点编码的LMW-GS等位基因出现的变异频率也非常高,因此从小麦近缘种中寻找新的候选优质谷蛋白基因对小麦品质改良具有重要意义。本研究以粗山羊草和栽培一粒小麦为材料,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、等电聚焦双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF×SDS-PAGE)、高效毛细管电泳(HPCE)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)等多种方法对HMW-GS和LMW-GS进行分离和鉴定,然后设计等位基因特异PeR(AS-PCR)引物对其编码基因进行分子克隆、序列测定与结构比较,分析贮藏蛋白基因家族的分子进化关系和预测谷蛋白的二级结构特征,并将来自粗山羊草和硬粒小麦的HMW-GS编码基因连接到表达载体上,使其在E.coli中高效表达,初步探讨其表达特性。主要研究结果如下: 1.粗山羊草HMW谷蛋白新亚基的分离与鉴定 利用SDS-PAGE,在粗山羊草T16、T132和T128中初步鉴定出了3个新的x-型HMW-GS,分别命名为1Dx1.6~t、1Dx3~t和1Dx5.2~t,同时发现一些新的亚基组合,如1Dx1.6~t+1Dy12.4~t,1Dx3~t+1Dy10.1~t和1Dx5.2~t+1Dy12~t。然后采用IEF×SDS-PAGE、HPCE和RP-HPLC三种分离方法对以上新亚基和亚基组合进一步表征和鉴定。结果发现,2-DE分离除1Dy12~t和1Dy10.1~t亚基外,其他亚基均分离出不同的多个蛋白组分,1Dx型亚基一般包括2-4个蛋白点。同时,在HPCE图谱中,这些亚基多表现为一个主峰加1-2个副峰,由此推测这些HMW-GS可能存在蛋白质的翻译后修饰。对粗山羊草HMW-GS的RP-HPLC分析表明,1Dx亚基疏水性大于1Dy亚基,这反映了它们理化性质的不同。MALDI-TOF-MS测得的1Dx1.6~t、1Dx3~t和1Dx5.2~t亚基的精确分子量分别为88565.8 Da、86934.5 Da和86651.2 Da。 2.粗山羊草HMW-GS编码基因的分子克隆、序列比较和进化分析


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