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可转化人工染色体(TAC)文库载体DNA制备的研究

宋琳琳  
【摘要】:大片段基因组文库是进行基因组研究、基因分离及其快速利用的一项重要的基础性工作,特别是对于大基因组生物来说更是如此。可转化人工染色体(Transformation-competent artificial chromosome,TAC)载体含P1噬菌体和Ri质粒的复制子,因而能够在大肠杆菌和农杆菌中以单拷贝形式穿梭复制。一旦筛选到目标阳性克隆,可直接利用农杆菌转化系统将其转到植物体中进行基因功能互补实验,省去了亚克隆的步骤。 高质量的载体DNA和高质量的大片段DNA是文库构建的两个基本要素,目前,已有文献多侧重于文库的构建及利用和高质量的大片段DNA的获得,对文库载体DNA制备的研究则少见报道。本论文以TAC载体pYLTAC17和pYLTAC747H为材料,针对高质量载体DNA制备过程中的关键步骤,如质粒载体的分离和纯化及检测、HindⅢ内切酶最佳完全酶切条件选择、HK脱磷酶最佳完全脱磷效果的载体白连检测、载体DNA与lambda DNA/hind Ⅲ连接能力的检测及转化克隆分析等进行了研究。主要结果如下:用QIAprep Spin Miniprep试剂盒分离纯化得到的载体pYLTAC17的浓度是300ng/ul,pYLTAC747H的浓度是400ng/ul;将所提纯的两种载体DNA电转化到大肠杆菌DH10B感受态细胞中,复苏培养液涂于LB+Kan25mg.L~(-1)(+5%蔗糖)平板,计算每ul在含有蔗糖和没有蔗糖的培养基上出现的菌落数的比例,分别是pYLTAC17为1:28885.7,pYLTAC747H为1:119600,均远小于1/5000,说明两种载体DNA中的sacB基因均功能正常,可以继续进行TAC文库构建的后续步骤;对两种闭环载体DNA分别用1U、2U、3U、5U和7U共5种不同梯度的HindⅢ酶切处理,电泳检测得出最适HindⅢ完全酶切条件是3U/ug闭环载体DNA,37℃,酶切30min;对最适HindⅢ酶切条件得到的两种线性载体DNA,分别用0.5MBU和1MBU共2种不同梯度的HK脱磷酶处理,经电泳和载体连接产物电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞两个方面的检测得出最佳HK脱磷酶完全脱磷条件是1MBU/ug线性载体DNA,30℃,脱磷1h;不同酶切、脱磷处理下所制备的两种线性载体DNA与lambda DNA/HindⅢ的连接产物经电转化大肠杆菌感受态细胞后涂布于LB+Kan 25mg.L~(-1)+5%蔗糖平板上进行培养,发现每ug载体DNA经3U HindⅢ完全酶切、1MBU HK完全脱磷后的转化频率最高,pYLTAC17为1.93×10~8,pYLTAC747H为2.86×10~8;随机挑取两种载体的转化子各5个进行检测,发现均有不同大小的插入片段,说明所制备载体的连接能力较好;每ug pYLTAC747H载体DNA经3U HindⅢ完全酶切、1MBU HK完全脱磷后,与lambda DNA/HindⅢ的连接产物电转化大肠杆菌ElectroTen-Blue感受态细胞,复苏培养液涂布于pH7.0的LB+12.5mg.L~(-1)潮霉素+5%蔗糖平板上进行培养,初步看出比电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞的转化效率高。本论文研究为后续多枝赖草TAC文库的构建奠定了基础。


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