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荧光光度法二氢叶酸还原酶抑制剂筛选模型的建立和应用

安会梅  
【摘要】:二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR, EC 1.5.1.3)是核酸代谢中关键的酶之一,是癌症药物治疗中的主要靶酶,近年来得到广泛的研究。二氢叶酸还原酶抑制剂能选择性的与二氢叶酸还原酶结合,抑制其催化还原活性,使二氢叶酸不能顺利转变为四氢叶酸,阻碍叶酸代谢,干扰DNA和蛋白质的合成,最终导致细胞死亡,所以二氢叶酸还原酶抑制剂具有抗癌、抗菌和抗疟的作用。近年来,有关二氢叶酸还原酶抑制剂的研究主要集中在新的抗癌类药物的合成及其定量构效关系的研究。因此有必要建立一种快速、准确、简单易行的方法对合成药物进行体外筛选。本文围绕荧光光度法二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选体系的建立与应用,进行了如下的工作: 第一章综述了酶活力的测定方法,影响酶催化反应的因素,荧光分析方法在酶分析中的应用。 第二章通过对二氢叶酸还原酶催化反应的反应物二氢叶酸、NADPH和产物四氢叶酸、NADP荧光性质的研究,用从Sigma公司购置商品酶建立了用荧光光度法测定二氢叶酸还原酶活力的体系,并应用于抑制剂的筛选。用建立方法对一些已知的二氢叶酸还原酶抑制剂进行检测,所得结果与文献报道结果一致。 第三章为了节约试剂成本,克服购置商品酶因活力较低而导致的实验现象不明显,实验条件难以实现,重现性较差等缺点,进一步优化二氢叶酸还原酶抑制剂筛选模型,本文按照Kaufman等方法,对从鸡肝中提取二氢叶酸还原酶进行了研究,并对每一步提取步骤的蛋白浓度和酶活力进行检测,得到进一步实验所需要的酶产品,效果较为满意。 第四章应用自己从鸡肝中提取的酶,建立了荧光光度法鸡肝二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选体系,并应用于合成抑制剂的筛选,效果较购置商品酶更为满意。 第五章将KMnO_4氧化和紫外光照结合起来,研究建立了测定痕量叶酸的荧光方法,并且详细研究了用硅藻土层析法对复杂样品进行前处理的方法和条件,简洁易行,经济且能有效消除干扰。采用这一处理方法,建立的荧光分析法可以直接用于测定奶粉和尿样中叶酸的含量。


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