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《首都师范大学》 2007年
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大肠杆菌基因工程菌生产番茄红素研究

卢韦  
【摘要】: 番茄红素是一种重要的类胡萝卜素,具有较强的抗氧化活性,能阻止低密度脂蛋白(LDL)和胆固醇的氧化,防止动脉粥样硬化和冠心病发生以及防治肺癌,膀胱癌,宫颈癌和皮肤癌等。近年来,番茄红素的制备工艺,特别是发酵法生产,受到研究人员的重视。 所有类胡萝卜素均是由共同的前体异戊烯焦磷酸(IPP)合成而来的。异戊烯焦磷酸(IPP)的合成是通过典型的甲羟戊酸途径或发现不久的非甲羟戊酸途径合成的。在大肠杆菌中,IPP的生物合成是由中心代谢途径的中间产物丙酮酸和3-磷酸甘油醛(G3P)分支合成的。 该研究中,我们在大肠杆菌工程菌(携带含欧文氏菌crtE,crtI和crtB基因的pACCRT-EIB质粒,该质粒有p15A复制起点,基因由自身的启动子控制)中过表达了能转化IPP为番茄红素的法尼基焦磷酸合成酶(ispA)和异戊烯焦磷酸异构酶基因(idi),通过控制中心碳代谢促进番茄红素合成。另外,结合代谢工程策略和优化过程的实验以使番茄红素产量最大化。主要内容如下: (1)从破壁方法、浸提溶剂及提取条件等方面对大肠杆菌工程菌番茄红素提取工艺进行了优化研究。结果表明酸-热法是大肠杆菌工程菌破壁提取番茄红素的最佳方法;丙酮是理想的提取溶剂。对破壁的条件(包括破壁的温度、时间、酸的浓度及添加量等)和提取的条件(包括浸提溶剂的添加量及浸提温度、时间等)进行了分析研究。优化得到适宜的破壁和提取条件为:盐酸浓度为4mol/L、盐酸溶液用量10 mL/g(湿菌体)、破壁温度35℃、破壁时间20min、丙酮添加量20mL/g(湿菌体)、浸提温度为40℃、浸提时间为2h、浸提级数为2次。 (2)研究了碳源、无机氮源、刺激物等对工程菌生长及色素累积的影响,确定了合适的培养条件:培养基为改良LB+M9培养基(蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L;甘油20g/L;Na_2HPO_4·7H_2O 12.8 g/L;CaCl_2 0.022 g/L;KH_2PO_4 3 g/L;NaCl 0.5 g/L;MgSO_4 0.48 g/L;NH_4Cl 1 g/L;(NH_4)_2SO_4 10 g/L;富马酸钠2 g/L;pH 7.0。);培养温度为33℃。发酵完成后工程菌的生物量(干重)为6.48g/L,番茄红素的最高含量可达10.6mg/L。 (3)ispA,idi和ispA-idi基因的克隆和表达:法尼基焦磷酸到牻牛儿牻牛儿焦磷酸的转化是在大肠杆菌工程菌中合成类胡萝卜素的第一瓶颈,其次是异戊烯焦磷酸的异构和法尼基焦磷酸的合成。移走这些瓶颈将会提供足够的前体来合成番茄红素等类胡萝卜素。我们分别克隆了大肠杆菌DH5α异戊烯焦磷酸异构酶(由idi基因编码)基因和法尼基焦磷酸合成酶(由ispA编码)基因。两个基因以及基因连接产物分别与欧文氏菌的基因簇(crtEIB)被导入大肠杆菌以产生抗氧化的橘红色番茄红素。番茄红素产量测定结果表明,工程菌DH5α(pACCRT-EIB,pUC19-ispA-idi)单位产量和单位体积产量分别提高了68.88%、68.92%。说明,引入的idi和ispA基因能够提高原来基因工程菌的番茄红素产量。 (4)构建了基因工程菌BL21(DE3)(pACCRT-EIB,pET28a(+)-ispA-idi),但菌生长缓慢,番茄红素产量下降。构建的重组质粒pET-28a-ispa-idi-EIB导入BL21(DE3)后,虽然能成功的合成番茄红素,但由于菌体生长受到严重影响,番茄红素产量十分低下。 (5)在摇瓶初步优化条件基础上进行了7L罐发酵实验,在更为优化的pH值、溶氧、碳氮量、溶氧量等条件下,原工程菌DH5α(pACCRT-EIB)和工程菌DH5α(pACCRT-EIB,pUC19-idi)的番茄红素体积产量分别达到20mg/L和66mg/L,单位产量与各自的摇瓶实验结果相近。
【学位授予单位】:首都师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q789

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