二氢叶酸还原酶—胸苷合酶的提取及抑制剂筛选研究

【摘要】： 二氢叶酸还原酶和胸苷合酶是DNA生物合成中的关键酶。因此，这两种酶被广泛用作包括抗癌、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗疟药在内的许多药物筛选的靶标分子，对其作进一步研究具有重要的现实意义。本文介绍了二氢叶酸还原酶和胸苷合酶的提取，以及高效毛细管电泳法在二氢叶酸还原酶反应动力学研究中的应用，包括酶反应动力学参数的测定及抑制动力学研究。 利用建立的二氢叶酸还原酶抑制剂的高效毛细管电泳法筛选模型，研究了人参皂苷Rg3、三七总皂苷、黄芩苷、木樨草素、表儿茶素、紫杉醇等6种从植物中提取得到标准品对二氢叶酸还原酶的抑制作用。研究结果表明，表儿茶素、木樨草素、紫杉醇对二氢叶酸还原酶有明显的抑制作用。 利用亲和层析法从鸡肝中提取得到了二氢叶酸还原酶，并利用紫外分光光度法测定了氨甲喋呤和表没食子儿茶素没食子酸酯对提取得到的鸡肝二氢叶酸还原酶的抑制作用。 建立了高效毛细管电泳法对鸡肝二氢叶酸还原酶活力的测定方法及其抑制剂的筛选模型。通过对产物NADP峰面积的定量测定，计算出鸡肝二氢叶酸还原酶的米氏常数。将已知的氨甲喋呤抑制剂作用于本文所建立的鸡肝二氢叶酸还原酶体系，发现测得抑制剂的半数抑制浓度与文献值相符，证明该体系可用于二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选。 胸苷合酶是胸苷酸生物合成中的关键酶，在快速增殖的细胞中抑制胸苷合酶的活性，可使DNA合成受阻，导致DNA链碎裂，引起细胞死亡，因此被广泛用作抗癌和抗感染病药物筛选的靶标分子，对其作进一步研究具有重要的现实意义。由于没有商品胸苷合酶出售，为了进行胸苷合酶的详细研究，我们通过细胞培养的方法，逐步提高培养基中氨甲喋呤的浓度，驯化出能耐高浓度氨甲喋呤的鼠李糖干酪乳杆菌菌株。发现在耐药菌体细胞中，胸苷合酶的含量得到了明显增加。