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《首都师范大学》 2009年
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代谢木糖产乙醇的酿酒酵母重组菌株的初步构建

张金鑫  
【摘要】: 随着国际能源价格的持续上涨,使用以廉价的木质纤维素类生物质原料制取燃料乙醇已具有重要的实践意义。木糖是大多数纤维素材料水解液中含量仅次于葡萄糖的一种单糖。由于传统乙醇发酵菌株酿酒酵母不能利用木糖,这为使用纤维素类原料发酵生产乙醇带来了困难。多年以来,人们试图通过基因工程、细胞融合等方法对已有的微生物进行改造,使其获得代谢木糖的能力和适应发酵纤维素水解液的性能。本文对国内外此领域的情况和研究进展进行了介绍。 为使酿酒酵母获得代谢木糖产乙醇的能力,至少须要在酿酒酵母细胞内表达木糖代谢途径的关键酶基因——木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2。本文首先分别克隆了休哈塔假丝酵母的木糖还原酶基因XYL1和热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因XYL2。由于这两种酶基因的相对表达水平会对乙醇的产生和木糖醇的积累产生重要影响,本文构建了含有诱导型启动子控制的木糖还原酶基因XYL1的酵母表达质粒pYES2-xyl1和含有组成型强启动子控制的木糖醇脱氢酶基因XYL2的酵母表达质粒pDR195-xyl2。而后将上述两个质粒分别转化酿酒酵母受体细胞,酶活测定结果显示,转化子中的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶均在宿主中得到活性表达,并通过蛋白质电泳方法进一步验证两个酶在受体细胞内的过表达。 通过对载体上的一系列未知序列进行测定和分析,确定了构建重组酵母染色体整合质粒的思路和技术路线。将木糖还原酶基因XYL1连同其表达元件从前期已构建好的酵母表达质粒pACT2-xyl1中克隆下来并将其与酵母染色体整合载体YIp5-KanR进行连接,构建出重组染色体整合质粒YIp5-KanR-x1。 本文完成了代谢木糖产乙醇的酿酒酵母重组菌株的初步构建工作,以期今后进一步构建重组染色体整合质粒YIp5-KanR-x12,通过同源重组的原理将上述基因整合到发酵性能良好的酿酒酵母基因组中,得到稳定代谢木糖产乙醇的酿酒酵母重组菌株。
【学位授予单位】:首都师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q78

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