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基于G-四链体为靶点的五种民族药用植物有效成分筛选和研究

刘婷婷  
【摘要】:由于缺乏抗肿瘤特效药物,恶性肿瘤严重威胁着人类尤其是少数民族地区人们的生命健康和社会的经济发展,成为阻碍我国全面建设小康社会的一大障碍。少数民族医药学是我国少数民族几千年传统文化知识的结晶,它们不但在历史上为本民族的生存和繁衍昌盛做出过重大贡献,时至今日仍为本民族和其他民族防病治病和卫生保健事业发挥重要作用。寻找抗肿瘤特效药的希望就寄托在经过长期研究和临床实践及药理验证,对治疗肿瘤有着巨大优势和潜力的民族医药上。本研究是在对民族传统医药知识文化的认知和尊重的基础上,以资源丰富、具有抗肿瘤潜力的民族药物及民族药用植物为研究对象,以DNA G-四链体为抗肿瘤民族药物研发的新靶点,运用民族学、民族植物学、生物学、天然有机化学、仪器分析等多学科知识,从民族药物中寻找高效、低毒的抗肿瘤新型靶向制剂。本文开展了传统民族医药有效单体成分靶向结合G-四链体抗肿瘤活性研究,并基于上一部分实验材料和实验仪器适用范围的摸索,建立了CD结合NMR高效、快速的筛选民族药用植物中靶向G-四链体活性小分子化合物的方法。以畲药紫玉兰(Magnolia liliiflora Desr.)为民族植物学研究对象,CD结合NMR的方法靶向G-四链体追踪紫玉兰活性部位,进而分离得到具有抗肿瘤潜力的小分子化合物。研究结果不但能为抗肿瘤特效药物研发提供参考,而且能为传统民族医药的现代开发提供新思路,同时建立的活性筛选方法切实可行,能高效、快捷的筛选民族药物复杂体系中结构已知甚至是未知的活性化合物。研究思路和方法值得推广应用于其他民族医药的研究与开发。具体研究如下:一、开展了传统民族医药有效单体成分靶向结合G-四链体抗肿瘤活性研究。通过查阅民族医药文献发现,藏药掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、维药茜草(Rubia cordifolia L.)及新疆紫草[Arnebia euchroma (Royle) Johnst.]、傣药木莲(Manglietia fordiana Oliv.)均被当地人用来清热、解毒,其有效单体成分芦荟大黄素、茜草素、紫草素、厚朴酚、和厚朴酚这些化合物在细胞水平上均具有一定抗肿瘤活性,但不明确是否作用于G-四链体达到抗肿瘤活性。小分子化合物空间上具有平面结构,理论上更容易靶向结合G-四链体。因此选择具有平面结构的上述民族医药有效单体成分为研究对象,研究靶向结合G-四链体活性,具体研究结果和结论如下:1、c-myc 2345序列形成了平行结构构型的G-四链体,可以用作民族药用植物与G-四链体相互作用研究的分子靶点。藏药掌叶大黄有效单体成分芦荟大黄素通过π-π堆积结合模式作用于c-myc 2345 G-四链体平面,芦荟大黄素与G-四链体以1:1形成络合物。研究结果表明藏药掌叶大黄有效单体成分芦荟大黄素具有靶向G-四链体抗肿瘤作用的潜力。2、维药茜草有效单体成分茜草素通过π-π堆积结合模式作用于c-myc 2345 G-四链体平面,茜草素与G-四链体以2:1形成络合物;维药新疆紫草有效单体成分紫草素能靶向结合c-myc 2345 G-四链体,形成2:1络合物,并通过沟槽结合和3’端的π-π堆积结合模式作用于c-myc 2345 G-四链体平面。研究结果表明维药茜草、新疆紫草有效单体成分茜草素、紫草素具有靶向G-四链体抗肿瘤作用的潜力。3、傣药木莲有效单体成分厚朴酚不能靶向结合c-myc 2345 G-四链体达到抗肿瘤作用,而其同分异构体和厚朴酚能够通过3’端π-π堆积和沟槽结合模式作用于c-myc 2345 G-四链体,和厚朴酚与G-四链体以2:1形成络合物。研究结果表明傣药木莲有效单体成分厚朴酚无靶向G-四链体抗肿瘤活性,和厚朴酚具有靶向G-四链体抗肿瘤作用的潜力。4、紫外吸收光谱和荧光光谱法是研究小分子与生物大分子相互作用的一种简单、常用方法,但其对小分子化合物的紫外吸收光谱性质要求较高,若小分子化合物与G-四链体的紫外吸收最大值波长处重合,则无法应用该方法进行实验。同时,紫外吸收光谱和荧光光谱法更善于发现π-π堆积结合模式的小分子化合物,NMR方法则能够发现弱结合及多种结合模式(沟槽结合、堆积结合)的小分子化合物。二、基于上一部分实验材料和实验仪器适用范围的摸索,建立了CD结合NMR高效、快速的筛选民族药用植物中靶向G-四链体活性小分子化合物的方法。以畲药紫玉兰(Magnolia liliiflora Desr.)为民族植物学研究对象,CD结合NMR的方法靶向G-四链体追踪紫玉兰活性部位,进而分离得到具有抗肿瘤潜力的小分子化合物,具体研究结果总结如下:1、CD变温实验最终确定95%乙醇为最适宜提取溶剂,其乙酸乙酯萃取层为分离的重点极性部位,进一步以石油醚-丙酮溶剂体系进行梯度洗脱后得到5个馏分,NMR实验确定馏分Fr.2(5:1)和Fr.3(3:1)为重点分离部位。2、根据靶向G-四链体追踪结果,利用常规硅胶柱层析(Silica gelCC),凝胶柱层析(Sephadex LH-20 CC)以及制备薄层层析(PTLC),共分离得到31个化合物。进一步利用UV、R、EI-MS、1-NMR、 13C-NMR以及2D-NMR (1H-1H COSY、HMQC、HMBC)等现代波谱技术,结合文献数据对比确定了31个化合物的结构,其中4个为新的木脂素化合物:liliflorin B (1), liliflorin C (2), liliflorin D (3), liliflorin E(4)。化合物5-22为已知的木脂素化合物,化合物23-27为已知的苯环化合物,化合物28-31为已知的倍半萜化合物。考虑到化合物的种类、新颖程度以及化合物的质量,选择了8个化合物为研究对象,利用NMR开展了其与G-四链体相互作用初步研究,发现化合物1,2,3,12,22具有靶向结合G-四链体的能力。3、化合物12(紫玉兰素A)质量足够,活性好,因此选择紫玉兰素A为与G-四链体相互作用的深入研究对象。研究结果表明紫玉兰素A(4.0μM)在K+缓冲液中可以将人端粒G-四链体的解链温度提高至69.93℃(△Tm=3.22℃),且不与DNA其他二级结构(双链DNA ds26、DNA发卡结构F10T、DNAG-四链体c-kit)相互作用,能够特异性以沟槽模式结合人端粒G-四链体,形成摩尔比1:1络合物。靶向G-四链体,从畲药紫玉兰中分离提取得到的紫玉兰素A具有靶向G-四链体抗肿瘤作用的潜力。论文的研究结果为传统民族医药靶向G-四链体抗肿瘤活性化合物的发现奠定物质基础,为高效、快速筛选民族药用植物靶向G-四链体的抗肿瘤活性小分子化合物提供了基础科学数据和技术支撑。论文所建立的研究方法能够应用于民族传统药物的二次开发,促进民族医药的现代利用,给少数民族人民带来经济效益,更好的促进我国民族地区经济和社会的发展。


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