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《中国政法大学》 2017年
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人类RNA定量的方法学建立及其法医学体液斑鉴定的应用研究

朱晓旭  
【摘要】:目的:探索建立人类特异的RNA定量体系。克服在后续RNA鉴定体液斑过程中人类总RNA初始加样量的不可控制导致的假阴性,保证实验的可重复性。方法:通过文献检索和NCBI核酸数据库序列比对,针对组织、细胞广泛高水平表达的管家基因RNA转录子(COX1),设计合成人类特异的引物和TaqMan探针,在荧光定量PCR平台上利用标准品标准曲线绝对定量原理,建立人类特异的RNA定量体系。本研究着重构建、验证了TaqMan探针法建立的DNA标准品荧光定量体系,利用Primer3.0和primer express3.0设计出人类特异的引物、探针,并检验此引物在人类和其他10种灵长类之间的特异性。采用“一人独立十次试验”和“两人分别独立实验”检验DNA标准品的稳定性。在此基础上,构建了SYBR Green I染料法的DNA标准品荧光定量体系和尝试构建RNA标准品荧光定量体系以作参考。为进一步分析DNA标准品(TaqMan)荧光定量系统效能,样本模拟了真实案件检材状况,采取陈旧的血液、唾液和加速老化处理的精液各15例,筛选国际通用的体液鉴定遗传标记基因进行qRT-PCR。通过控制RNA初始模板上样量分析COX1定量系统有效性:?50pg RNA(Ribogreen Quant-it)用于cDNA合成;?COX1定量;?加入固定拷贝数的RNA用于cDNA合成:血液样本加入105拷贝RNA,唾液样本加入30000拷贝RNA,精液样本加入1000拷贝RNA。对比分析COX1定量前后数据变化,验证此定量系统的灵敏性、稳定性和重复性。结果:COX1定量体系在人类特异性、灵敏性、稳定性上都充分展示了极好的系统性能。特异性:即便在10种灵长类动物中也保持了高度特异性。一方面可以有效地排除案件样本中细菌、真菌等非人生物RNA的干扰,一方面作为种属鉴定工具,比鲁米诺等预实验试剂更灵敏、准确,具有广泛适用性。灵敏性:当统一加入50pg RNA时,三种样本的组织特异性基因Ct值均跨越范围大,荧光定量曲线无规律分散分布。血液SPTB基因Ct值跨越34.53-42.4,相差7.87个循环;唾液HTN3基因Ct值跨越31.62-37.22,相差5.6个循环;精液PRM2基因Ct值相差13.370个循环。利用COX1标准品体系定量可知,样本所含拷贝数千差万别:15个血液样本拷贝数相差11863.243,唾液样本拷贝数相差31918.901,精液样本拷贝数相差387.741。将三组样本初始加样量统一调整至固定拷贝数,组织特异基因均发生明显变化。血液样本Ct值幅度缩减为3.9062个循环。33%的阴性样本转变为阳性;唾液样本Ct值聚集在27-28,31.5-33循环之间;精液样本Ct值缩减至7.804。以上Ct值变化可以直观的从荧光定量曲线分散程度观察到。以上数据充分证明了COX1定量系统具有极高的灵敏性。稳定性:在保存长达半年标准品的10次独立试验中,10次绝对定量标准曲线仅有微小变化,斜率、截距、R2以及效率的变异系数分别为:1.31、0.79、0.03和1.82。检验手法差异的2人独立试验中,荧光定量曲线也高度重合,利用两组样本数据制作绝对定量标准曲线时,数据点位几乎都在拟合的线性方程上,R2=0.9953。COX1标准品的稳定性确保了实验的可重复性以及数据的有效性。结论:本研究初步建立了人类特异RNA定量体系,通过RNA鉴定体液体系进行验证,初步证明了RNA定量体系具有高度特异性、灵敏性和稳定性。
【学位授予单位】:中国政法大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:D919.4

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