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《南开大学》 2010年
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纳米氧化锌对海马神经元电生理特性的影响及对PC12细胞生物学效应的机制研究

赵景霞  
【摘要】:纳米材料是指至少在一维空间上粒径≤100nm的材料,由于其尺寸很小,结构特殊,因此具有许多新的物理化学特性,如小尺寸效应、大的比表面、极高的反应活性、量子效应等。随着纳米技术的产业化,各种纳米材料因其优良特性及新奇功能而具有广泛的应用前景,遍及工业、农业、制造业、军事、医疗等诸多领域。而日常的生活用品,如化妆品、食品、织物、涂料、抗菌材料等,也含有纳米材料,人们接触纳米材料的机会日益增多。由此,纳米材料的生物效应和安全性问题也凸显出来,尤其是纳米颗粒对人体健康、生存环境和社会安全等方面是否存在潜在的负面影响。毒理学研究结果表明纳米颗粒可以各种途径进入人体或生物体,包括吸入、摄食吸收、皮肤渗透等,随后在生物体的不同水平产生毒理学效应。最近的研究显示中枢神经系统亦是纳米颗粒作用的重要靶器官。因此纳米颗粒对中枢神经系统的影响也得到更多的关注,纳米颗粒可以通过最强的生物屏障,如血脑屏障。可以通过嗅神经途径进入中枢神经系统,并转至不同脑区沉积。且脑区中的海马亦是纳米颗粒作用主要的靶点。 纳米ZnO因其独特的光、电、磁学等性能的重要应用而取得突破性的成就,并倍受瞩目。同时,在化妆品、纺织、涂料、陶瓷、催化、抗菌、医疗诊断等方面都有很好的应用。目前体内外的实验证实纳米ZnO可在不同程度上对细菌、水生生态动物、哺乳动物细胞及哺乳动物产生毒性作用,然而纳米ZnO对神经系统的影响鲜有报道。本文采用神经生长因子(NGF)诱导分化的PC12细胞,利用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞存活率、荧光标记法测定ROS含量、流式细胞仪分析凋亡细胞比例等方法,探索纳米ZnO对PC12细胞的神经毒性影响。 由于中枢神经系统神经细胞膜表达多种类型的离子通道,细胞膜上离子通道开放引起的电活动是一切细胞生理功能活动的基础。离子通道参与递质释放、激素分泌、信号转导、代谢调控及细胞生长乃至学习和记忆等重要生理过程的调控。而离子通道又是许多药物和毒物作用的靶点,因此,实验进一步采用全细胞膜片钳技术,研究记录了纳米ZnO对海马锥体神经元离子通道的影响,包括对电压门控钠通道、钾通道、钙通道及其神经元兴奋性活动的影响,以分析纳米ZnO对神经系统作用的潜在机制。 主要实验结果如下: 1.MTT法检测细胞存活率:不同浓度的纳米ZnO(10-6g/ml,10-5g/ml,10-4 g/ml)与神经生长因子(NGF)诱导分化的PC12细胞共孵育6、12、24h后,细胞存活率随着浓度和时间增大而下降,表现为时间依赖性和浓度依赖性。而10-4g/ml的纳米ZnO可明显降低PC12细胞的存活率(P0.05)。 2.细胞内ROS含量的变化:不同浓度的纳米ZnO(10-6g/m1,10-5g/ml,10-4 g/ml)与PC12细胞共孵育6h后,经GENMED工作液和GENMED保存液处理。使用倒置荧光显微镜观察,设定激发光波长为490nm,散发波长530nm。与对照组的荧光强度相比,ZnO处理组的荧光强度随浓度增加而逐渐增强,说明细胞内ROS含量增高。 3.流式细胞仪分析凋亡细胞比例:不同浓度的纳米ZnO(10-6g/ml,10-5g/ml, 10-4g/ml)与PC12细胞共孵育24h后,与正常细胞凋亡率(8.75%)相比,10-4g/ml的纳米ZnO促进PC12细胞的凋亡(34.24%,P0.05);而预先给培养的PC12细胞加入ROS清除剂MPG(3 mM),再用10-4g/ml的纳米ZnO处理PC12细胞24h,凋亡比例降至15.78%(P0.05)。提示ROS清除剂可抑制纳米ZnO诱导PC12细胞凋亡 4.ROS清除剂的保护作用:培养的PC12细胞用3 mM的ROS清除剂MPG预处理30min后,加入10-4g/ml的纳米ZnO孵育24h,PC12细胞的存活率增大,与10-4g/ml的纳米ZnO组相比,差异显著(P0.05)。 5.纳米ZnO对海马锥体神经元电压门控钠通道的影响:10-4g/ml的纳米ZnO在阶跃电位-50mV~+20mV显著提高了海马神经元电压门控钠电流(INa)的电流幅度(P0.05),I-V曲线下移;药物作用前后激活曲线无明显改变;稳态失活曲线左移且Vh变化明显,分别为-52.54±0.43 mV和-54.67±0.39mV(P0.01),k值没有明显变化;失活后恢复曲线左移,药物作用前后时间常数(τ)分别为5.40±0.19 ms和3.95±0.15 ms(P0.01) 6.纳米ZnO对海马锥体神经元电压门控钾通道的影响:10-4g/ml的纳米ZnO提高了海马神经元瞬时外向钾电流(IA)和延迟整流钾电流(IK)的电流幅度,其中在阶跃电位+20mV~+90mV更为显著地提高了IK的电流幅度(P0.05);而药物作用前后IA和IK的激活曲线变化不明显;并且,药物作用前后IA的稳态失活曲线及失活后恢复曲线也未有显著改变。 7.纳米ZnO对海马锥体神经元高电压激活的钙通道的影响:在实验组和对照组,海马锥体神经元高电压激活的钙电流表现为run up和随后的run down现象。而10-4 g/ml的纳米ZnO对海马神经元高电压激活的钙电流有上调作用,从最初作用的10分钟开始,到记录结束的30分钟纳米ZnO在阶跃电位-15 mV~+15 mV显著地提高了高电压激活的钙电流幅度(P0.05);与对照组相比,激活曲线及稳态失活曲线没有显著改变。 8.纳米ZnO对海马锥体神经元兴奋性活动的影响:电流钳结果显示,10-4 g/ml的纳米ZnO提高了单个动作电位的幅值及超射(P0.01),缩短了动作电位的半宽时程(P0.05);提高了连续动作电位的频率(P0.05);提高了自发放电的频率(P0.05)。 主要实验结论如下: 1.纳米ZnO可降低PC12细胞的存活率,表现为时间依赖性和浓度依赖性;并促进细胞凋亡;细胞内ROS的增加是纳米ZnO诱导PC12细胞凋亡的机制之一。 2.纳米ZnO通过延迟整流钾通道增加K+外流使细胞质中K+减少而诱导细胞凋亡 3.纳米ZnO上调HVA Ca2+通道,引起细胞内Ca2+浓度升高,将导致ROS产生,并由此促进细胞凋亡。 4.纳米ZnO通过增加钠通道的电流幅度,并使钠通道快速失活,及失活后快速恢复而提高神经元的兴奋性,进而可能对神经元产生去极化诱导的损伤;纳米ZnO通过上调HVA Ca2+通道将改变细胞内钙稳态,将由此增强神经退行性过程。 5.纳米ZnO通过增大INa、IK及HVA Ca2+电流的电流幅度而导致神经元兴奋性增加,并使单个动作电位的幅值及超射增加,动作电位的半宽时程缩短;提高了连续动作电位和自发放电的频率。后续重复放电的跨膜电位幅度和超射值的减小与纳米ZnO造成的Na+-K+-ATP酶的功能不足有关。
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