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《南开大学》 2010年
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苏云金芽孢杆菌几丁质酶特性分析及其基因启动子序列的确定

刘东  
【摘要】:苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3菌株(Bacillus thuringensis subsp.colmeri 15A3,简称Bt 15A3)能够组成型表达两种几丁质酶ChiA和ChiB,对甜菜夜蛾和棉铃虫均具有较高的杀虫活性。 为了研究两种几丁质酶的酶学特性及其杀虫抑真菌的作用,我们将两种几丁质酶基因在大肠杆菌(Escherichia coli) XL-Blue中异源表达。经过硫酸铵沉淀、透析、Sephadex G-200凝胶层析,最终得到初步纯化的两种几丁质酶。分别确定了它们的分子量,ChiA为36 kDa, ChiB为70 kDa。酶谱分析证明,有活性的ChiA分子量约为72 kDa,有活性的ChiB分子量为70 kDa。我们对两种几丁质酶的酶学特性进行了研究:ChiA的最适温度与pH分别为50℃和5,在20-60℃、pH 4-8范围内酶活稳定。ChiB的最适温度与pH分别为60℃和5,在20-60℃、pH 4-8范围内酶活稳定。金属离子等效应物对ChiA与ChiB酶活影响存在差异。抑真菌孢子萌发实验表明几丁质酶ChiA与ChiB具有明显的抑真菌作用。ChiA、ChiB对产黄青霉和黄瓜灰霉孢子萌发的半抑制浓度(IC50)分别为10-11μg/mL和4μg/mL左右。ChiA抑制效果明显低于ChiB。甜菜夜蛾、棉铃虫杀虫增效实验证明几丁质酶ChiA与ChiB具有明显的杀虫增效作用,确定了对两种供试昆虫的半致死浓度(LC50)。添加ChiA的样品,可以使Bt 15A3对甜菜叶蛾和棉铃虫的LC50分别降低18%和19.8%。添加ChiB的样品,可以使Bt 15A3对甜菜叶蛾和棉铃虫的LC50分别降低26%和30%。 为了验证ChiB异源表达的剪切现象,本研究首先对纯化后的64kDa蛋白进行了质谱分析,将质谱所获标签序列与70kDa ChiB原序列比对,证明64kDa蛋白为70kDa ChiB蛋白C-端剪切的产物,缺少了部分酶结合域。 为了探讨Bt几丁质酶结合域的功能,利用NCBI蛋白结构数据库对ChiB的结构域组成进行了分析。根据分析结果构建系列C-端缺失蛋白,获得了部分缺失及全部缺失功能域、分子量为66kDa、64kDa及60kDa的3种蛋白。酶活检测证明,缺失结合域的Chi66、Chi64和Chi60都具有酶活性。与野生蛋白ChiB一样,Chi66、Chi64与Chi60都可以降解胶体几丁质,并能够分解荧光底物MU-(GIcNAc)3,但是不能降解MU-(GlcNAc)2,证明缺失结合域后,降解不同底物的特性没有变化。因此可以确定ChB、Chi66、Chi64与Chi60均为内切几丁质酶。缺失结合域的各种蛋白的酶学适性稍有差异。不同金属离子等效应物对缺失蛋白的影响也存在差异。抑真菌活性测试发现,Chi66与Chi64具有良好的抑真菌孢子萌发活性,缺失全部几丁质结合域的Chi60对黄瓜灰霉与产黄青霉的抑制效果很差。研究结果表明几丁质结合域对几丁质酶抑真菌起到重要作用。 为了确定几丁质酶ChiB有效的上游启动子序列,根据生物信息学软件与文献预测得到两个chiB潜在启动子序列。为了确定哪一个启动子是正确的调控序列,根据预测结果构建了四个缺失上游调控序列的chiB基因,分别称为chiB△59、chiB△102、chiB△122、chiB△248。chiB△59缺失上游序列59bp,chiB△102缺失102bp,缺失了预测的启动子1。chiB△122缺失122bp,缺失了预测的启动子2。chiB△248缺失了248bp,上游序列完全缺失。将四种缺失基因与T载体连接并在大肠杆菌(Escherichia coli)XL-Blue中表达,获得重组蛋白。几丁质酶活检测、目的蛋白检测与目的mRNA表达量检测三个水平的分析验证表明,缺失启动子1后,chiB基因仍有一定转录、表达。缺失启动子2后,chiB基因未转录、表达。因此确定预测启动子2为正确的启动子序列。启动子序列位于-126bp—-166bp的位置(ATG为+1),含有完整的与E.coliσ70启动子同源的-10区与-35区。
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