比较基因组学的生物信息学分析方法建立及极端嗜酸甲烷氧化细菌V4、大肠杆菌O55：H7菌株CB9615和K-12菌株BW2952及其5株衍生菌株的全基因组破译

【摘要】：基因组学的发展已经经历了近二十年的历史。随着新测序方法的出现,大大加快了基因组测序的步伐。如何处理和分析这些基因组数据成为基因组学研究中的主要困难。 本论文建立的两种全新的生物信息学方法均能够大大加快比较基因组学的工作速度,并且得到更准确的分析结果。以这两个方法为主要工具,结合其他功能基因组和比较基因组学方法,本论文对8个细菌基因组进行了生物信息学分析,并且发现其各自的重要特性。 通过这些方法的建立和研究的进行,我们能够进一步加深对微生物的理解,特别是加深对微生物遗传信息的了解,并且极大促进相关分子生物学的生理生化特性的研究工作。 Ⅰ 随着高通量测序法的发展,基因组的数量急剧膨胀,使比较基因组学成为后基因组时代的研究热点。比较基因组学通过比较全基因组序列来分析生物之间进化关系,遗传差异和潜在表型差异。直系同源基因的寻找是比较基因组学的基础问题,为比较基因组学的后续工作提供基础。直系同源基因寻找程序主要分为基于BLAST的方法和基于进化树重建的方法,但是现有的所有直系同源基因寻找程序都依赖于原有的注释。 本论文选取大肠杆菌种和古菌界的完整基因组序列为研究材料,设计了全新的基于基因与基因组比较的直系同源基因寻找程序。这个程序使用BLAST方法进行基因预测,并使用Inparanoid方法将基因比较为直系同源基因对,最后使用MCL程序将基因对进一步聚类,形成直系同源基因群。 程序突破了直系同源基因寻找依赖于原有注释的瓶颈,在大肠杆菌和古菌中发现了比原来更多的核心基因群,并重建了两个种属的进化树,同时发现在大肠杆菌中有显著的基因消减现象。 Ⅱ 比较基因组学的一个关键问题是对生物的进化关系的重建。分子遗传学中重建进化树的基础是生物DNA或氨基酸序列上的碱基改变。突变是造成这种碱基改变的一个重要原因,突变随着时间经过而发生,从而形成进化中的树状结构；然而,同源重组也是导致碱基改变的一个重要原因。同源重组用一个异源的片段替换基因组的原本片段,从而在短时间内引入大量的碱基改变。重组可以在远源的物种之间发生,从而打乱生物的树状进化结构。这两种造成碱基改变的方式通常难以区分,但是对进化树重建有重要影响。 本论文中引入泊松分布模型来描述随机突变,并通过统计学方式初步区分重组与突变。为了确定重组影响的程度和范围,我们还是用独创的MaxFisher方式对相邻片段间的碱基分布进行区分,进而将基因组区分为重组区和突变区。 使用区分后的突变,可以进行进化树重建,得到更加准确的进化结果。同时,论文中发现,重组不但可以影响进化树的枝长,从而误导进化分子钟的推算,还可以直接影响进化树的拓扑结构,从而使我们无法得到真正的物种亲缘关系。 Ⅲ 极端嗜酸的甲烷氧化细菌Methylacidiphilum inferorum V4可以在极端酸性的地裂环境中降解地壳喷发的甲烷,降低温室气体的排放。极端酸性的地裂环境中每年释放大量的甲烷,然而先前的研究中,使用通用引物无法在酸性环境下发现甲烷氧化细菌。目前已知的甲烷氧化细菌都属于原细菌门,最低生长PH值仅为4.0。 本论文中描述了一个极端嗜酸的甲烷氧化细菌Methylacidiphilum inferorum V4,并使用全基因组测序方法取得了V4的全基因组序列。 与原有的甲烷氧化细菌不同,V4属于疣微菌门,并且可以在2.0-2.5的pH值下生长。本研究在甲烷氧化细菌Methylacidiphilum inferorum V4的基因组中发现了独特的甲烷氧化途径,并分析了V4的核心代谢和其他重要功能途径,并且在全基因组中发现大量的横向转移事件。 Ⅳ 目前已进行的大肠杆菌基因组研究缺乏对具有亲缘关系的克隆之间的详尽遗传改变的研究。大肠杆菌O157：H7是重要的肠出血型致病大肠杆菌,它在世界范围内造成过多次大流行,而与它亲缘关系最近的O55：H7属于另一个致病类型,这两者之间的特性差异是由于基因组上的遗传改变造成。 本论文中完成了对一株O55：H7菌株的全基因组测序,并且将它与两个O157：H7菌株进行基因组学和蛋白质组学水平的比较。本论文对它们之间的包括突变,重组和横向基因转移等大多数遗传差异都进行了定位,并使用同义突变来对它们的分化时间做出了估计。作为参照,我们还研究了3株密切联系的肠外致病大肠杆菌基因组。 O55：H7和O157：H7的主要差别包括一个导致O抗原变换的重组区域。此外,O55：H7中有一个特异的二型分泌系统,而O157：H7中则有更多的三型分泌系统作用因子。他们之间噬菌体也发生了很大的改变。如果使用之前在霍乱弧菌中的进化速率,O55：H7和O157：H7分化时间大约为400年前,如果使用传统分子钟,分化时间大约为14,000到70,000年左右。通过肠外致病大肠杆菌簇的验证,本研究发现大肠杆菌中重组频率比霍乱弧菌中要低。 V 大肠杆菌标准菌株K-12菌株MC4100是最常用的实验室菌株之一。在80年代使用冻干保存之前,K-12菌株在世界各地的实验室中经过了长期的传代过程,其中包括大量记录的和未被记录的遗传改变。这些改变使不同的K-12菌株之间遗传背景出现差异,并导致了全局调控和表型的差异。 本研究对大肠杆菌K-12菌株MC4100进行了全基因组测序,并将其与其它3株已测序的K-12菌株进行比较。在所有已测序K-12菌株内部发现了193个特异的点突变以及许多插入和缺失事件。 通过将这些点突变和插入缺失事件关联,可以解释许多K-12菌株之间的表型差异,然而还有很多点突变的功能未知。这些遗传改变中的大部分都不是人工操作的结果,而是随机的遗传改变。这些变异说明即使在实验室环境中,也需要考虑遗传背景差异带来的潜在实验差异。 Ⅵ 物种进化的多态性是进化中的一个关键问题。传统认为这种多态性是由于环境中复杂的选择压力造成。然而最新的研究证明,即使在单一的选择压力环境下,物种也倾向于通过多种不同的方式适应环境。 本论文通过对大肠杆菌MC4100在同一实验室恒化条件下产生的5个子代进行全基因组测序和蛋白质组学研究,深入解析由磷限制带来的遗传改变,发现细菌通过以rpoS为核心的调控基因的改变来增强对环境的适应能力。 经过一个月左右的进化,MC4100单一菌株的子代出现了显著的分化。进行测序的5个子代通过对不同调控基因的突变改变了自身的环境适应能力。本论文通过这一实验说明细菌在单一选择压力下可以通过不同的调控基因改变来适应环境。

【关键词】：生物信息学 比较基因组学 直系同源 重组 虚拟外参 极端嗜酸甲烷氧化菌 大肠杆菌O55:H7 大肠杆菌O157:H7 分子钟 大肠杆菌K-12MC4100 进化
【学位授予单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：Q78
【目录】：