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《南开大学》 2010年
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大肠杆菌氧胁迫适应性蛋白质组学、O-抗原研究和嗜热菌NG80-2醛脱氢酶分子生物学研究

李晓敏  
【摘要】:一大肠杆菌氧胁迫适应新蛋白组学和0-抗原研究 大肠杆菌是重要的模式生物,为人和动物肠道中的正常栖居菌,在卫生环境不良的情况下,常随粪便散布在周围环境中,兼性厌氧。在有氧条件下进行有氧呼吸产能,在无氧条件下进行无氧呼吸和发酵产能。人们对大肠杆菌有氧无氧环境间的转换适应机制做了深入研究,但是对于影响细菌对环境转变适应过程中细胞组分的变化却极少研究。本文对大肠杆菌在微氧条件下的实验室突变株进行了比较蛋白质组学研究。比较了在有氧及无氧条件下两株ptsG突变株与原始菌株之间的蛋白质表达的差异,发现在突变株中由于调控蛋白ArcA变化引起的TCA循环、呼吸链、发酵代谢的适应性变化,以及突变株中葡萄糖和铁离子摄取能力增强,这些变化对大肠杆菌对无氧条件的适应性起到关键作用。我们推测大肠杆菌在无氧条件下ArcA调控的发酵产能和呼吸链变化对细菌是一个负担,细菌更倾向于维持有氧呼吸的模式来产能,供给细胞生长。 0-抗原是革兰氏阴性菌最主要的表面多糖抗原,由于长期受到来自宿主的选择压力,具有非常丰富的多样性,大肠杆菌有166种0-抗原,志贺氏菌有33种0-抗原,其中13种0-抗原为二者所共有。细菌0-抗原重复单位一般含有三到八个单糖,这些单糖一般分为两类:一类是细菌细胞在代谢过程中出现的常见的单糖及其衍生物,例如:葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等。第二类单糖为细菌中0-抗原中特有的罕见单糖,包括多种单糖、糖衍生物、糖类似物等,一般是由第一类单糖经过多酶反应后产生。例如GDP-mannose、GDP-rhamnose、GDP-colitose等。它们能在人与动物体内产生强烈的免疫反应,而这些单糖存在于细菌表面也是为了产生新的抗原从而逃避宿主免疫系统的识别和攻击。因此对这些糖的研究有助于我们了解细菌表面0-抗原与人体免疫系统之间的关系。很多罕见单糖也存在于其他生物大分子中,如糖蛋白、糖脂及细菌的二次代谢产物包括抗菌素,并对这些大分子的生物活性有着不可替代的作用,尤其是一些罕见单糖的合成基因与抗菌素的合成及活性有关。我们测定了大肠杆菌0161的0-抗原结构,发现了大肠杆菌0161 0-抗原中含有与大肠杆菌061和01080-抗原,以及军团菌、空肠弯曲菌等致病菌0-抗原和鞭毛蛋白中结构非常相似的罕见单糖Leg衍生物-Leg5Ac7Ala,这是首次发现7位丙氨酸修饰的Leg罕见单糖衍生物,为了研究该罕见单糖的合成途径,我们破译了大肠杆菌0161和061的0-抗原基因簇,并比较了三株大肠杆菌0-抗原基因簇序列,推测了大肠杆菌0161中Leg5Ac7Ala的合成途径。 二嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2部分功能基因组学研究 嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans) NG80-2是在我国大港油田分离的一株耐高温(最适生长温度为65℃)长链(C15-C36)烷烃降解菌。该菌能够利用原油作为唯一碳源和能源,在高温缺氧的深层油藏环境中良好地生长,并可有效地提高轻、重质烷烃的比例和改善原油流动性。深入研究和利用该菌的特性对于石油工业和环境保护都具有重要意义。实验室前期已完成了该菌的全基因组序列的破译。 本研究对NG80-2菌中的一个醛脱氢酶(ALDH)基因GT3117进行了体外功能鉴定。ALDH在大肠杆菌中进行了异源表达,其表达产物为同源四聚体,ALDH的底物范围非常广,能不可逆氧化不同碳链长度的直链醛(C1-C20)以及一些芳香醛,包括苯甲醛、苯乙醛、邻氯苯甲醛、邻苯二甲醛,其最适底物为甲醛,最适温度为60℃,最适pH为8.0。ALDH只能利用NAD作为辅酶,为NAD依赖的醛脱氢酶。本研究对NG80-2中另外6个ALDH进行了序列分析,发现这6个ALDH均不属于烷烃降解醛脱氢酶家族,只有GT3117编码的ALDH属于长链烷烃降解家族,因此,可以确定其在长链烷烃降解途径中催化第三步反应。由于ALDH也能降解短链烷烃和芳香烃,我们推测它在细胞内还参与其他代谢途径,在微生物采油和石油生物污染治理等工业中具有重要的应用价值。
【学位授予单位】:南开大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q78

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