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《南开大学》 2010年
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地衣芽孢杆菌MY75几丁质酶特性及表达调控元件的研究

肖亮  
【摘要】:MY75菌株是本室保藏的一株革兰氏阳性、芽孢杆菌。当培养基中有几丁质存在时,该菌株能够大量表达胞外几丁质酶,且酶活力在筛选的近1000株芽孢杆菌中是最高的。 为了明确MY75菌株的分类地位,首先对该菌株进行了鉴定。在鉴定过程中发现,MY75菌株16S RNA序列与枯草芽孢杆菌菌群(Bacillus subtilis group)中的芽孢杆菌之间具有高度的相似性,而不能利用目前广泛采用的16S RNA序列分析法进行有效地区别。于是,又以另两个蛋白编码基因gyrA(编码DNA促旋酶A亚基,gyrase subunit A)和rpoB(编码DNA介导的RNA聚合酶p亚基,RNA polymerase subunit beta)序列为依据,并参照Biolog微生物自动鉴定的结果,最终确定MY75菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifromis) MY75菌株在培养96小时后,产生的胞外几丁质酶达到顶峰—4.645 U/mL使用从该菌培养上清液中制备的粗蛋白进行了抑真菌实验,发现几丁质诱导后的菌株粗蛋白能够完全抑制小麦赤霉(Gibberella saubinetii)和黑曲霉(Aspergillus niger)孢子的萌发,而未经诱导的样品则没有此效果,初步证明MY75菌株培养上清液的抑真菌活性来源于其高量表达的胞外几丁质酶。 将MY75菌株培养液上清中的粗蛋白进行初步分离纯化,经酶谱分析技术检测,发现一条特异的、约55 kDa大小的蛋白带表现出几丁质酶活性。对该蛋白进行飞行时间质谱(time-of-flight mass spectrometer, TOF MS)分析,发现其氨基酸序列与蛋白质数据库中的地衣芽孢杆菌67 kDa大小的几丁质酶同源性很高。根据GenBank中已提交的地衣芽孢杆菌几丁质酶序列设计引物扩增并克隆了MY75菌株中的几丁质酶基因chiMY75。该基因的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)长度为1797 bp,编码599个氨基酸,预测蛋白大小为67 kDa。该ORF序列与GenBank中已有的地衣芽孢杆菌几丁质酶基因序列的相似性达99%。将chiMY75亚克隆至表达载体pET28a并转化E. coli。在转化子细胞的破碎上清液中检测到了特异表达的67 kDa大小的蛋白。 对异源表达的几丁质酶ChiMY75的特性进行了研究。该酶的最佳作用pH值为7.0,最佳作用温度为50℃。锰、铬、锌、银四种离子能够显著地降低ChiMY75的活性;而锂、钠、镁离子则对酶活力有轻微的促进作用;铜和铁两种离子则会使该蛋白完全失去活性。在抑真菌活性检测中,酶活力为6.32 U/mL的ChiMY75能够完全抑制小麦赤霉和黑曲霉的孢子萌发。在杀虫生物测定中,ChiMY75的加入使得苏云金芽孢杆菌对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼虫的毒力提高了27%。 为了对芽孢杆菌几丁质酶的调控元件进行研究,克隆了MY75菌株几丁质酶基因完整序列chiMY75full,包括ORF及其上游调节区域的432 bp。同时将本室前期克隆的苏云金芽孢杆菌15A3菌株的几丁质酶完整基因chiB也作为研究对象。利用软件对上述两个几丁质酶基因的上游调节序列进行了分析,预测出潜在的启动子序列等调控元件。序列分析发现,二者的上游序列中均存在长度为16 bp的正向重复序列。两个完整的基因都可以利用自身携带的启动子在E. coli中大量表达几丁质酶。对所发现的重复序列分别进行了定点的部分及全部缺失,从酶活性、蛋白表达量以及特异mRNA转录量三个水平观察缺失基因调控表达的变化。酶活检测结果证明,缺失chi基因正向重复序列的转化子培养液的酶活力明显高于完整chi基因的转化子;蛋白质SDS-PAGE电泳结果显示,缺失正向重复序列的一系列chi基因所表达的几丁质酶蛋白量显著高于完整的chi基因的转化子;Northern Blot结果显示,缺失重复序列之后,与两种几丁质酶基因相对应的mRNA转录量也有显著提高。这些结果证明,芽孢杆菌几丁质酶基因中的正向重复序列,是基因表达时的负控制调节元件,很有可能是转录抑制物的结合位点。定点缺失结果还显示,缺失全部重复序列的chiB基因与缺失部分重复序列的chiB基因相比较,三个检测水平都明显增高。 本研究中,我们将MY75菌株鉴定为地衣芽孢杆菌。通过在E. coli中的异源表达,确定了MY75菌株中几丁质酶的抑真菌活性及对苏云金芽孢杆菌杀虫的增效作用。在2株芽孢杆菌几丁质酶编码基因的上游,均发现了正向重复序列,通过对正向重复序列的定点缺失,证明该序列是几丁质酶基因表达的负调控元件,能在转录水平上控制几丁质酶的表达。本研究不但为芽孢杆菌几丁质酶基因调控机理的研究提供了基础,还证明了MY75菌株在生物防治方面的应用潜力
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