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《南开大学》 2014年
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连体动物模型的构建及内环境影响老年肾损伤关键因子的研究

宁一纯  
【摘要】:背景:人口老龄化已经成为全球性公共卫生问题。伴随老年人口日益增多,老年肾脏病患者也随之增多。肾脏是伴随着衰老而出现明显形态和功能改变的重要器官之一,老年人群是慢性肾脏病(Chronic kidney disease, CKD)和急性肾损伤(Acute kidney injury, AKI)的高危人群。研究老年肾脏的衰老及急慢性肾损伤的发病机制,探讨其在发生及发病过程中的关键因子,为临床治疗提供有用的线索,具有非常重要的意义。我们的前期研究发现,机体内环境对肾脏器官衰老进程有着重要的影响,证实内环境状态的改变可以逆转或加速肾脏衰老进程。 目的:本研究在本实验室前期研究的基础上提出原创性的科学假说:衰老机体内环境中可能存在某些促进/抑制器官衰老的体液因子,通过影响自噬、凋亡和炎症因子的基因调控,促进器官衰老或使衰老器官变年轻。我们主要采用连体动物模型及与肾脏缺血/再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)模型的组合来探讨内环境对肾脏衰老及老年肾脏缺血/再灌注损伤的作用研究。 方法:取3月龄和20月龄雄性C57BL/6小鼠,建立小鼠连体动物模型并在连体后第1周及第2周主要采用小动物活体成像验证模型成功与否;研究内环境对肾脏衰老的具体分组:(1)青年小鼠单个对照组6只,(2)青年-青年同龄小鼠连体7对,(3)青年-老年异龄小鼠连体3对,(4)老年-老年同龄小鼠连体4对,(5)老年小鼠单个对照组6只;连体术后饲养5周采血、留取肾脏组织,进行衰老指标p16、SA-β-gal,凋亡指标cleaved caspase-3,自噬指标LC3、p62、多聚泛素聚集体的、vestern blot检测,观察内环境对肾脏衰老的影响;研究内环境对老年肾脏急性肾损伤的实验分7组(具体包含10个亚组):(1)青年小鼠假手术组(Y:SO),(2)青年小鼠双侧肾脏缺血再灌注损伤模型组(YIRI),(3)青年小鼠-青年小鼠连体受体小鼠双侧肾脏缺血再灌注损伤模型组(Y-Y:IRI),(4)青年小鼠-老年小鼠连体受体小鼠双侧肾脏缺血再灌注损伤模型组(Y-O:IRI),(5)老年小鼠-老年小鼠连体受体小鼠双侧肾脏缺血再灌注损伤模型组(O-O:IRI),(6)老年小鼠双侧肾脏缺血再灌注损伤模型组(O:IRI),(7)老年小鼠假手术组(O:SO);IRI是在连体术后3周进行的,双侧肾脏缺血30分钟后再灌注24h时采血检测血清肌酐、尿素氮值,留取肾脏组织后行PAS及TUNEL染色观察肾组织病理变化及肾小管上皮细胞凋亡情况,并采用双盲评分法对肾脏的病理损伤程度打分及对TUNEL阳性细胞计数;利用细胞因子芯片QAM-CAA-2000分析以上各亚组中3-5只小鼠的血清,筛选出各组间有显著差异的细胞因子,运用聚类分析找出可能影响肾脏衰老及老年急性肾损伤的细胞因子。采用短期热量限制对老年大鼠进行饮食干预后,来探究肾脏衰老的分子机制,其中自噬和氧化损伤是我们的研究侧重点。 结果:(1)成功构建了连体小鼠动物模型,并应用解剖观察、小动物活体成像扫描以及绿色荧光蛋白转基因小鼠进行了连体小鼠间血液循环相通的验证;为接下来的研究奠定了基础。(2)异龄连体小鼠术后生存率显著低于同龄连体小鼠。异龄连体中老年小鼠的肾脏形态及功能未发生显著性变化,与同龄连体老年小鼠表现相近。异龄连体中老年小鼠肾脏的衰老相关性指标p16和SA-β-gal均未有显著性改善,但有改善趋势。异龄连体中老年小鼠肾脏的凋亡标志物cleaved caspase-3有所降低,但不具有统计学差异。异龄连体中老年小鼠肾脏的自噬水平有增高趋势,但不具有统计学差异。运用高通量筛选方法发现血液循环系统中可能与衰老密切相关的细胞因子有6种,分别为IGFBP-2、Eotaxin-2、 Fractalkine、CD27、LIX和SCF,衰老时,这6种细胞因子均升高;而异龄连体5周后,青年内环境可使老年小鼠血清中这6种细胞因子水平降低。(3)本部分研究对老年大鼠应用短期CR,发现对肾脏衰老标志性蛋白有改善作用,提高肾脏细胞的自噬水平;同时发现,短期CR能减少老年大鼠肾组织中线粒体氧化性损伤,从而提出自噬活性的高低可能是决定肾脏衰老的关键环节。(4)在连体动物模型基础上建立肾脏IRI模型,分别构建了青年小鼠假手术对照、青年小鼠IRI模型、青年-青年连体中受体青年小鼠1RI模型、青年-老年连体中老年小鼠IRI模型、老年-老年连体中受体老年小鼠IRI模型、老年小鼠IRI模型、以及老年小鼠假手术对照。首次发现:与老年-老年连体中受体老年小鼠IRI模型比较,青年-老年连体中老年小鼠IRI模型的24h血清肌酐和血清尿素水平明显降低,肾组织损伤程度减轻,肾小管上皮细胞凋亡数少,提示青年内环境能够显著减轻老年小鼠的急性缺血/再灌性肾损伤。而且,我们同样采用了高通量筛选的方式,对上述研究对象的血清做了120种细胞因子的差异性筛选,最后得到7种细胞因子可能是内环境与AKI损伤密切相关的,分别为IGFBP-2、Fractalkine、EGF、SDF-lalpha, CXCL16、TNF RII和ACE。当AKI发生时,异龄连体后的老年小鼠在IRI24h时血清中这7种细胞因子的变化同青年小鼠AKI时。 结论:(1)成功构建了连体小鼠动物模型,并应用解剖观察、小动物活体成像扫描以及绿色荧光蛋白转基因小鼠进行了连体小鼠间血液循环相通的验证。(2)完成了青年-青年、青年-老年和老年-老年连体动物模型的建立和术后的5周观察,及在连体动物模型基础上建立了肾脏IRI诱导的AKI模型。(3)发现异龄连体中老年小鼠肾脏的衰老指标、凋亡水平、自噬水平均有改善趋势。(4)发现异龄连体中老年小鼠IRI模型肾组织损伤程度较老年同龄连体模型中受体老年鼠IRI模型组轻,提示青年内环境可能能够减轻老年鼠IRI诱导的肾损伤。(5)运用高通量筛选方法发现血液循环系统中可能与衰老密切相关的细胞因子有6种,而与老年AKI可能密切相关的细胞因子有7种。
【学位授予单位】:南开大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R-332

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