收藏本站
《南开大学》 2009年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

红色亚栖热菌海藻糖合成酶相关基因的克隆、表达以及海藻糖代谢途径的研究

朱玥明  
【摘要】: 海藻糖因其具有保护生物分子活性的功能,被广泛应用于食品加工业、农业、医药业等诸多领域。在海藻糖的酶转化法工业生产中,海藻糖合酶(trehalosesynthase)只需一步反应即可将麦芽糖转化为海藻糖,生产原料可来源于淀粉的水解产物,更为廉价,因此备受关注。而筛选稳定的、转化率高的、适合工业生产的海藻糖合酶,并构建高表达的工程菌株,成为降低海藻糖生产成本的关键因素。 在本实验的前期工作中,从地热水中筛选得到一株能够生产海藻糖合酶的耐热菌株CBS-01。对其海藻糖合酶的初步分析显示,该酶的最适反应温度为50℃,最适pH为6.5,在50℃以下和pH 5.0-9.0的范围内该酶能够保持80%以上的酶活。鉴于该海藻糖合酶具有较强的稳定性,有必要克隆得到该酶的基因并构建工程菌株,为海藻糖的工业生产奠定基础;另一方面,也有必要对该酶的结构、作用机制以及耐热机制进行研究,为进一步提高该酶的热稳定性和转化率提供充分的理论依据。 首先,对这株能够生产海藻糖合酶的菌株进行了鉴定。该菌为革兰氏阴性的杆菌,多个细胞相连接可形成丝状,能够产生暗红色色素,好氧,生长的最适温度和pH分别为55℃~60℃和7.5~8.5。在生理生化试验中,该菌与标准菌株红色亚栖热菌(Meiothermus ruber ATCC 35948)的测试结果完全一致。该菌基因组的G+C含量为62.1%,与红色亚栖热菌标准菌株的DNA-DNA杂交率为63.9%。该菌的16srDNA基因与Genbank中红色亚栖热菌呈现最大的相似性。综合以上实验结果,该菌被鉴定为亚栖热菌属红色亚栖热菌(Meiothermus ruber CBS-01)。 第二,克隆得到了海藻糖合酶的基因。根据已报道的海藻糖合酶同源序列中保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,结果得到一长度为762bp,编码254个氨基酸的基因片段。通过对其编码的氨基酸序列的相似性搜索表明,所扩增片段为新的潜在的海藻糖合酶基因的部分DNA序列。在此基础上,采用接头PCR、TAIL-PCR以及混合质粒PCR筛选基因组DNA文库的方法共得到全长为6200 bp的核苷酸序列。序列分析发现,该序列中共含有三个ORF区:第一个ORF区的长度为1350bp、编码449个氨基酸;第二个ORF区的长度为690 bp、编码229个氨基酸;第三个ORF区的长度为2889 bp、编码962个氨基酸;通过比对发现这三个ORF区分别是潜在的6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)、6-磷酸海藻糖磷酸酶(TPP)和海藻糖合酶(TreS)基因。即在红色亚栖热菌CBS-01中存在两条海藻糖的合成途径,而且这三个基因很可能位于同一个多顺反子中。通过对所得到的潜在的海藻糖合酶氨基酸序列的分析,发现红色亚栖热菌的海藻糖合酶与栖热菌属的海藻糖合酶的同源性最高,且蛋白的分子量远远大于其他种属的海藻糖合酶,预示所发现的海藻糖合酶可能具有较好的热稳定性。同时还发现,克隆得到的潜在的海藻糖合酶属于α-淀粉酶家族,在其氨基酸序列中具有四个α-淀粉酶家族的保守区。这些结果也进一步证实所得到的序列为潜在的海藻糖合酶基因。 第三,构建了生产海藻糖合酶的工程菌株,并优化了表达条件。将潜在的编码海藻糖合酶的基因序列转化到大肠杆菌中进行表达,通过高效液相色谱(HPLC)检测了粗酶液的酶活。结果显示,该序列所编码的蛋白具有海藻糖合酶的活性,能够实现麦芽糖和海藻糖之间的相互转化反应,并有少量副产物葡萄糖生成。该基因序列已经注册到NCBI的GenBank中(序列接收号为EU443098)。为了增加海藻糖合酶在大肠杆菌中的表达量,利用PCR定点突变技术,将海藻糖合酶基因5'末端的核苷酸进行了优化,大幅度提高了该酶的表达量。同时通过对诱导表达条件的优化,确定了发酵生产海藻糖合酶的最适条件:采用pET-21a载体在胞质中表达目的蛋白,选用E.coli Rosetta-gami(DE3)作为宿主菌,20℃、低转速过夜诱导,以降低包涵体的生成,获得更多的可溶且有活性的目的蛋白。利用所构建的大肠杆菌工程菌株发酵生产海藻糖合酶的比活为0.60U/ml发酵液,比发酵红色亚栖热菌的0.08U/ml提高了大约8倍。 第四,纯化了重组海藻糖合酶,并对其酶学性质做了详细的研究。利用NTA-Ni柱亲和层析法纯化得到了重组海藻糖合酶。测定了重组海藻糖合酶的各项动力学常数,并发现葡萄糖是该反应的竞争性抑制剂。测定海藻糖合酶的酶活为80U/mg,最适反应温度为50℃,最适pH为6.0-7.0。并且发现该酶在较宽的温度(4-60℃)和pH值(pH 4.0-8.5)范围内都极其稳定;更为突出的是,该酶在60℃中保温5h后,残余酶活仍然能够达到90%以上,而且4℃冷藏保存2个月对该酶的活性几乎不会产生影响。从而证明该酶非常适合工业化生产海藻糖。同时,实验还确定在低温下反应更利于降低副产物葡萄糖的形成,提高海藻糖的产量。以麦芽糖作为底物,20℃下反应,最终可以得到大约64%的海藻糖,而副产物葡萄糖的含量不到2%。 第五,构建了缺失C端结构域的海藻糖合酶蛋白,发现该蛋白并不具有海藻糖合酶的活性。根据Native-PAGE的结果,TreS以四聚体形式存在,而TreSΔC蛋白形成二聚体结构。从而,我们推测来源于红色亚栖热菌的海藻糖合酶是以四聚体的形式行使功能,而C端结构域对四聚体的形成具有十分重要的作用,该结构域的缺失导致酶不能以正确的构象存在,故而活性丧失。 第六,对红色亚栖热菌的海藻糖代谢途径做了初步研究。将潜在的编码TPS和TPP的基因序列转化到大肠杆菌中进行表达,利用NTA-Ni柱纯化得到了两个蛋白,并通过薄层层析(TLC)检测到了其酶活。基因序列已经注册到NCBI的GenBank中(序列接收号分别为FJ360766和FJ360767)。同时,研究发现红色亚栖热菌在高盐环境压力下胞内积累的内溶物为6-磷酸海藻糖。我们推测6-磷酸海藻糖磷酸酶在表达方面可能具有一定缺陷,不能将生成的6-磷酸海藻糖转化为海藻糖。
【学位授予单位】:南开大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q93

手机知网App
【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 刘艳超;王宇凡;钱柯帆;张峻;肖辰鹏;邢来君;李明春;;分段DNA shuffling:一种大分子海藻糖合酶有效的定向进化方法[J];微生物学通报;2013年02期
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前7条
1 洪登峰;万丽丽;杨光圣;;侧翼序列克隆方法评价[J];分子植物育种;2006年02期
2 丁顺华,王宝山;海藻糖在植物抗性方面的研究进展[J];山东师大学报(自然科学版);2000年04期
3 韦宇拓,朱绮霞,罗兆飞,陈发忠,李桂媛,黄鲲,黄日波;耐放射异常球菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定[J];生物化学与生物物理进展;2004年11期
4 梁峰,刘秀花,刘茵;复性速率液相分子杂交法测定芽孢杆菌DNA杂交度[J];商丘师专学报;2000年02期
5 任红妍;嗜热微生物[J];生物学通报;1995年03期
6 陈朝银,林连兵;栖热菌目、科、属、种[J];微生物学通报;2003年05期
7 戴秀玉,王忆琴,杨波,周坚;大肠杆菌海藻糖合成酶基因对提高烟草抗逆性能的研究[J];微生物学报;2001年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 吴丛梅,黄天华,吴德生,谢庆东,徐小虎;pEgr-P16重组质粒的构建及其在EC9706细胞中的辐射诱导表达[J];癌变.畸变.突变;2003年04期
2 阮烨,王晓云,谢庆东,黄天华;外源DNA转染精子的实验研究[J];癌变.畸变.突变;2004年03期
3 欧阳松应,徐寿水,沈文律,周传香,李春艳,欧阳红生;人PTEN基因表达载体的构建及其在U_(251)细胞中的表达[J];癌变.畸变.突变;2004年04期
4 陈传德,吴中亮,陈家堃;乙酸镍诱导的人支气管上皮细胞系转化细胞基因组不稳定性分析[J];癌变.畸变.突变;2005年01期
5 熊小芳,黄天华,谢庆东,王晓梅,陈桂兰;精子携带的HBV DNA在小鼠早期胚胎中的复制与表达[J];癌变.畸变.突变;2005年03期
6 吕慧贞;张建朋;陈新;刘静;张元湖;;一种改进的鸭梨总RNA提取方法[J];山东农业科学;2007年05期
7 张秀华;王文锋;;微卫星DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术的探讨[J];山东农业科学;2009年06期
8 张学民,王金生;碱裂解法提取质粒DNA方法的改进[J];安徽大学学报(自然科学版);2000年04期
9 倪大虎,向太和,张盘娣,吴家道,杨剑波,贾士荣,余增亮;应用低能离子束将抗菌肽ShivaA基因导入恢复系明恢63的研究(简报)[J];安徽农业科学;2000年04期
10 许晓风,郁锋,杨启银,陈育如,彭荣淮,贺海生,王程辉;烟草工业下脚料综合利用研究(I)——抗菌成分的提取与抑菌效果测定[J];安徽农业科学;2003年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈杰;叶兴国;何聪芬;杜丽璞;董银卯;;基因枪介导转化芦荟获得转基因植株的研究[A];2005年全国作物遗传育种学术研讨会暨中国作物学会分子育种分会成立大会论文集(二)[C];2005年
2 黄家强;卜夏;李卓娅;龚非力;;人TNFα分泌型、跨膜型和跨膜稳定型重组体的构建表达及杀瘤效应[A];生命科学与生物技术:中国科协第三届青年学术年会论文集[C];1998年
3 郭昱嵩;王中铎;刘楚吾;陈志明;刘筠;;勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)线粒体DNA全序列的测定与分析[A];中国海洋学会2007年学术年会论文集(下册)[C];2007年
4 樊继德;孔庆国;张梅;于喜艳;;子房注射法获得转基因甜瓜植株[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
5 李俊华;吴少庭;翁亚彪;甘燕;刘洪波;刘茂铃;张仁利;高世同;黄达娜;耿艺介;;弓形虫表面抗原SAG2基因体外扩增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表达[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
6 李俊华;吴少庭;翁亚彪;甘燕;刘洪波;刘茂铃;张仁利;高世同;黄达娜;耿艺介;;弓形虫致密颗粒蛋白GRA4基因体外扩增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表达[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
7 唐小江;马争;黄建勋;黄汉林;李来玉;牛侨;;正己烷引起红细胞膜血影蛋白交联的研究[A];中国环境诱变剂学会抗诱变剂和抗癌剂专业委员会第三次全国学术会议、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第五届学术交流会、贵州省环境诱变剂学会成立大会暨首届学术交流会论文集[C];2004年
8 严家彬;李新辉;吴淑勤;杜合军;;鳜鱼病毒核酸特异片段表达及高效价抗体制备[A];可持续水产养殖——资源、环境、质量——2003水产科技论坛论文集[C];2003年
9 赵晓瑜;柳伟强;李晓霞;;蚯蚓抗菌肽40kDa Fetidin基因的原核表达与复性[A];2007年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2007年
10 张核子;王保捷;丁酶;肖仰哲;巴颖;李剑平;李春梅;刘利民;赖跃;;短串联重复位点FGA扩增片段长度多态性研究[A];第二次全国法医物证学学术交流会论文集[C];1998年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 姜颖;低温下节杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶催化效率及表达调控[D];兰州大学;2010年
2 梁勇;白念珠菌高铁还原酶基因表达调控及Aft2p转录因子的功能研究[D];南开大学;2010年
3 于双妮;胰腺癌差异表达microRNAs的鉴定及功能研究[D];北京协和医学院;2008年
4 陈其华;前癃通胶囊治疗良性前列腺增生症临床观察及其对间质细胞作用的实验研究[D];湖南中医药大学;2011年
5 马丽菊;云南宣威肺癌细胞系侧群细胞特征分析[D];昆明医学院;2011年
6 陈熙明;节杆菌中的渗透压胁迫感受器调节细胞分裂以及细胞壁发育[D];兰州大学;2011年
7 张海红;节杆菌电转化方法的优化及6-磷酸海藻糖酯酶基因的功能研究[D];兰州大学;2011年
8 陈良;油菜抗逆相关基因的鉴定和功能研究[D];华中师范大学;2011年
9 许雷;大青杨纤维素合酶基因的克隆与遗传转化的研究[D];东北林业大学;2011年
10 朱伟;摄食抑制因子NUCB2/Nesfatin-1对机体胰岛素敏感性的影响[D];重庆医科大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 朱晓娟;重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL的构建、表达、纯化及初步鉴定[D];南京医科大学;2009年
2 钱静;携带Apoptin双调控溶瘤腺病毒治疗肝癌的研究[D];浙江理工大学;2010年
3 辛宁;PDX-1真核表达载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达[D];郑州大学;2010年
4 陆玉成;AMF基因在食管鳞癌细胞株中的表达及功能初步分析[D];郑州大学;2010年
5 吕文兵;杜氏盐藻异养转化藻株的鉴定及初步功能分析[D];郑州大学;2010年
6 李静;父源性HLA-A基因与子痫前期相关性研究[D];郑州大学;2010年
7 张燕松;肾移植术后患者PBMCs中NF-κB的活性和TNF-α mRNA的表达研究[D];郑州大学;2010年
8 张磊;杜氏盐藻(Dunaliella salina)GPI多克隆抗体的制备及其在MDCK细胞中的定位[D];郑州大学;2010年
9 冯玖玲;杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的克隆及功能研究[D];郑州大学;2010年
10 陈操;日本七鳃鳗抗增殖蛋白Prohibitin1研究及类B淋巴细胞免疫调节初探[D];辽宁师范大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 张红缨,孔祥铎,张今;蛋白质工程的新策略——酶的体外定向进化[J];科学通报;1999年11期
2 王宇凡;朱玥明;魏东盛;张峻;邢来君;李明春;;利用定点突变分析海藻糖合酶的功能[J];微生物学通报;2009年05期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 刘传斌,云战友,鲁济青,苗蔚荣;海藻糖的分析方法[J];食品与发酵工业;1998年05期
2 封德顺;海藻糖的生物学功能简介[J];生物学通报;1999年02期
3 杨琳,王金发;海藻糖在生物工程中的应用[J];生物学通报;1999年04期
4 蔡妙英;杨寿钧;刘俊风;卫军;;一个产生L-乳酸脱氢酶的嗜热菌的新种——非解朊栖热菌[J];微生物学报;1992年04期
5 王三根,邓如福,裴炎,王瑜宁;海藻糖提高绵阳15号小麦幼苗耐盐能力的研究[J];西南农业大学学报;1992年02期
6 刘传斌,云战友,冯朴荪,苗蔚荣;海藻糖在生物制品活性保护中的应用前景[J];中国医药工业杂志;1998年07期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈红歌,吴坤,顾溯海,胡元森,贾新成,董志扬,金城;酵母菌6-磷酸海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达及功能验证[J];农业生物技术学报;2005年03期
2 井瑞洁;王腾飞;王文风;林艳;王瑞明;;海藻糖合酶固定化及细胞透性化技术的研究进展[J];酿酒科技;2008年07期
3 井瑞洁;王腾飞;王瑞明;;海藻糖合酶研究进展[J];中国酿造;2008年15期
4 韦航;马少敏;张云光;梁树华;;海藻糖的酶转化法生产技术[J];安徽农业科学;2010年22期
5 丁振;刘建龙;王瑞明;;细菌纤维素固定化海藻糖合酶的研究[J];中国酿造;2006年09期
6 李坤;王双玉;陈红漫;;海藻糖合酶产生菌筛选、鉴定及目的基因克隆[J];生物技术;2007年02期
7 陈颖;朱月明;张峻;李明春;齐欣;唐柳;;海藻糖合酶基因工程菌诱导表达条件的研究[J];食品工业科技;2009年11期
8 张冰君;宣劲松;;条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因全长cDNA的电子克隆[J];生物信息学;2008年01期
9 刘建龙;谭海刚;王瑞明;杨连生;;产海藻糖合酶菌株筛选的研究[J];中国酿造;2006年03期
10 王俊峰;陈红漫;尚宏丽;阚国仕;;耐高温海藻糖合酶产生菌鉴定及生长特性研究[J];生物技术;2007年02期
中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 朱玥明;红色亚栖热菌海藻糖合成酶相关基因的克隆、表达以及海藻糖代谢途径的研究[D];南开大学;2009年
2 刘俊梅;水生栖热菌海藻糖合酶体外定向进化及重组菌BL35细胞透性化技术研究[D];吉林农业大学;2011年
3 徐军;甜菜夜蛾滞育激素—性信息素合成激活肽基因(DH-PBAN)和促前胸腺激素(PTTH)基因的克隆和表达分析[D];中国科学技术大学;2007年
4 乔利仙;紫菜遗传多样性分析及其6-磷酸海藻糖合成酶基因转化水稻的研究[D];中国海洋大学;2007年
5 吴为胜;植物抗逆基因:GbTPS与BnPrx的克隆和表达分析[D];复旦大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前5条
1 徐汝意;制备透性静息细胞生产海藻糖技术研究[D];山东轻工业学院;2011年
2 吴秀丽;金黄节杆菌海藻糖合酶基因的克隆与功能鉴定[D];中国农业科学院;2009年
3 王晓丽;高效制备啤酒酵母细胞海藻糖的关键技术研究[D];吉林大学;2011年
4 张颖;利用扣囊复膜酵母菌A11菌株转化木薯淀粉生产海藻糖的研究[D];中国海洋大学;2010年
5 吴嘉;海藻糖对酿酒酵母1912菌株酒精耐受性及发酵影响的研究[D];云南大学;2012年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026