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《天津大学》 2011年
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两亲性可降解聚阳离子核酸载体及层层组装的核酸传递系统

郭术涛  
【摘要】:核酸(DNA、SiRNA)在癌症、心血管疾病、病毒感染等疾病的治疗和预防上将发挥重要作用,但需要依靠有效的载体运送才能到达靶细胞。病毒载体虽然能够高效传递基因到靶细胞,但安全性、免疫原性、成本高以及转基因片段小等缺点限制了其作为基因载体的应用。为了克服病毒载体存在的缺陷,合成类非病毒载体成为研发的重点。非病毒载体具备可以大规模生产、低免疫原性、易修饰和可负载大的基因片段等优点,但传递效率仍需提高,因此,本文试图通过合成的阳离子聚合物及其与核酸组装系统的结构调控来构建高效的核酸递送系统。 本文首先通过开环聚合和原子转移自由基聚合的方法制备了两亲性共聚物聚己内酯-接枝-聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯阳离子接枝共聚物(PCL-g-PDMAEMA)。PCL-g-PDMAEMA具有较低的临界聚集浓度:8.1×10-4 g/L,在水中可组装成表面带有正电荷的纳米粒(NPs),具有同时负载疏水性药物和核酸的功能。载有紫杉醇的PCL-g-PDMAEMA NPs对紫杉醇的释放具有pH依赖性的温度敏感性,在37°C、pH为7.4的缓冲液中释放紫杉醇的速率非常缓慢,而随着pH降低,PCL-g-PDMAEMA NPs对紫杉醇的释放速率加快。体外转染实验结果表明,与市售转染试剂Lipofectamine 2000相比,在较低N/P下,负载DNA的PCL-g-PDMAEMA NPs对293T、HepG2和PC-3等多种细胞有较高的转染效率,且5%的血清可促进PCL-g-PDMAEMA NPs在293T细胞上的转染效率。激光共聚焦显微镜研究发现PCL-g-PDMAEMA NPs/DNA复合物可以从溶酶体内逃逸。因此,PCL-g-PDMAEMA NPs有希望称为一种有效的核酸载体,但不足的是有一定的细胞毒性。 为了降低PCL-g-PDMAEMA的毒性,本文继而对该共聚物进行了PEG修饰。采用ROP和ATRP聚合方法合成了两亲性共聚物mPEG-b-(PCL-g-PDMAEMA) (PECD)。当N/P大于4时,PECD NPs可以将DNA完全阻滞,并形成粒径在60-160 nm、表面带有约10-18 mv电荷的复合物。尽管PECD/DNA复合纳米粒在较高N/P下仍呈现较高的细胞毒性,但PECD NPs/DNA复合物即使在较低N/P (N/P=5)下,对HeLa、HepG2等肿瘤细胞以及难于转染的原代神经细胞DRG的转染效率也要高于Lipofectamine 2000、PEI与DNA的复合体系。而在N/P=5时,PECD/DNA的细胞毒性与Lipofectamine 2000、PEI与DNA的复合体系相当。激光共聚焦荧光显微镜研究表明两亲性PECD/DNA NPs从溶酶体的逃逸能力明显强于PEI,且稳定性比PCL-g-PDMAEMA/DNA强。可见,PEG的修饰,在一定程度上改善了PCL-g-PDMAEMA基因传递的性能。 为了进一步提高核酸载体体系的性能,本文通过静电层层组装的方法,用PCL-g-PDMAEMA NPs、DNA和PGA-g-PEG (聚谷氨酸-接枝-聚乙二醇)三种物质制备了三元复合物核酸传递体系,即在PCL-g-PDMAEMA NPs/DNA二元复合物表面再组装上一层PGA-g-PEG。研究表明: PGA-g-PEG的加入对PCL-g-PDMAEMA NPs/DNA二元复合物的稳定性没有影响,使复合物表面剩余正电荷大大减少,有效提高了复合物的细胞相容性。体外细胞转染结果证明PCL-g-PDMAEMA NPs/DNA/PGA-g-PEG三元复合体系的转染效率明显高于二元复合物,同时死细胞数量大大减少。激光共聚焦显微镜研究表明转染时三元复合物的稳定性优于二元复合物的稳定性,且细胞对三元复合物的摄取量明显多于对二元复合物的摄取量。另外,三元复合物从溶酶体内的逃逸能力也要强于二元复合物的逃逸能力。本文还把叶酸引入到复合物的表面,并通过小鼠尾静脉注射三元复合物观察体内转染效果,发现带有叶酸靶向基团的三元复合物在肿瘤组织内的转染效率大大高于不含靶向基团的三元复合物,而在其它脏器中没有发现有基因表达。由此可见,PCL-g-PDMAEMA NPs/DNA/PGA-g-PEG三元复合物作为核酸的纳米递送系统具有潜在的应用前景。 本论文的最后一部分工作是将具有电荷翻转功能的聚烯丙胺柠康酸酐衍生物(PAH-Cit)和聚乙烯亚胺在金纳米粒上进行组装,制备了用于基因转染和siRNA传递的金纳米粒复合载体。siRNA的PAGE凝胶电泳结果证明了在酸性条件下PAH-Cit确实可以发生电荷翻转。PEI/PAH-Cit/PEI/MUA-Au NPs/DNA在HeLa和293T细胞上具有很好的转染效率,高于PEI和lipofectamine体系。当Au/siRNA质量比为10.0时,PEI/PAH-Cit/PEI/MUA-Au NPs转染siRNA抑制HeLa细胞Lamin A/C基因的效率最高,达到80.0%,明显高于Lipofectamine 2000转染siRNA抑制效率(66.0%)。细胞毒性实验表明PEI/PAH-Cit/PEI/MUA-Au NPs没有明显细胞毒性。采用CLSM研究Cy5-siRNA/PEI/PAH-Cit/PEI/MUA-AuNPs复合物在细胞内的分布情况发现,对于Cy5-siRNA/PEI/PAH-Cit/PEI/MUA-AuNPs复合物而言,siRNA大多分布在细胞浆内,且呈分散、弥漫状态,表明siRNA从溶酶体向细胞浆内释放效率较高,有利于发挥siRNA的功能性。因此,这种层层组装及电荷翻转功能的核酸传递体系为高效的核酸递送系统的开发提供了新途径。
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