收藏本站
《天津大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

Klebsillae pneumoniae XJPD-Li重组甘油脱水酶特性及其复活动力学研究

徐小琳  
【摘要】:1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,以1,3-丙二醇为单体合成的新型聚酯材料具有良好的应用前景。甘油脱水酶是利用微生物发酵甘油生产1,3-丙二醇的限速酶,催化甘油脱水生成3-羟基丙醛。本论文针对课题组获得的甘油转化率高、生产强度大的1,3-丙二醇高效合成菌株Klebsiella pneumoniae XJPD-Li,研究其重组甘油脱水酶的催化特性、结构特征及其复活特性。 从K. pneumoniae XJPD-Li总基因组中扩增得到了甘油脱水酶基因片段,与甘油脱水酶(U30903)序列进行比对,其α亚基的第193和407位,β亚基的第47和189位的非活性中心氨基酸残基存在差异。成功构建了E. coli BL21(DE3) (pET-28a(+)-dhaBCE)表达系统,诱导条件经优化(0.8 mmol·L-1IPTG,20℃,3h),可大量表达高活性的重组甘油脱水酶,其可溶/不溶形式的比例提高到1.432,比酶活达64.5 U?mg-1。通过亲和层析快速分离纯化得到了电泳纯的重组甘油脱水酶,比活力提高2倍,酶活回收率47.5%。重组甘油脱水酶具有良好的催化性能,最适催化温度为45℃,最适pH为8.0,最适底物为甘油,对辅酶的亲和能力较强,热稳定性较好,对氧环境不敏感,其热失活动力学符合一级失活动力学模型,在氧失活及辅酶类似物失活过程中,其活性随时间呈指数衰减。 K. pneumoniae XJPD-Li重组甘油脱水酶为典型的α/β型结构,具有多个柔性结构区域,α亚基407位差异氨基酸位于柔性区域,疏水性有较大改变。针对该位点构建的突变体E407A,经研究发现其酶活性降低至突变前的30%左右,Km值相对突变前增大,最适催化温度降低,突变前后甘油脱水酶的二级结构没有明显变化,荧光光谱分析发现谱图有轻微扰动,说明该位点的氨基酸残基变化对甘油脱水酶的催化活性和构象有一定影响。利用分子动力学模拟进一步研究了甘油脱水酶非活性中心氨基酸残基对酶结构的影响,发现α和β亚基非活性中心氨基酸残基的变化对甘油脱水酶RMSD值和分子内及分子间氢键有较明显的影响,特别是对活性中心的稳定性有促进作用,使得酶结构更加紧密,稳定性提高。 对重组甘油脱水酶复活特性研究发现,重组甘油脱水酶复活因子主要以包涵体形式存在,通过亲和柱上复性可一步获得高纯度活性蛋白,回收率为20.7 %,比活性为60.6 min-1·mg-1。复性液中添加比例为6: 1的氧化还原体系(GSH:GSSG),以及添加ATP有利于甘油脱水酶地快速复活。针对甘油脱水酶复活过程参考乒乓理论建立了复活动力学模型,并对参数进行了求解。考察了甘油脱水酶体外复活寿命的调控,通过对复活体系的调控将甘油脱水酶的复活寿命提高一倍。
【学位授予单位】:天津大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q78

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张怀;袁其朋;朱亚平;马润宇;;重组Hepcidin融合蛋白的金属螯合亲和层析纯化[J];北京化工大学学报(自然科学版);2005年06期
2 陈阳;陈劲春;;重组人胰岛素的体外复性纯化[J];北京化工大学学报(自然科学版);2009年01期
3 高强中国水产科学研究院黄海水产研究所;郝建华;王跃军;于建生;孙谧;;海洋芽孢杆菌酯酶BSE-1的催化动力学和热失活动力学研究[J];分子催化;2008年04期
4 刘东波,李丹,陈珊,包晓军;黑曲霉木聚糖酶同工酶的性质及圆二色谱分析[J];分子科学学报;2004年04期
5 冉华松;王崇辉;杨翔华;佟明友;;1,3-丙二醇的应用与市场[J];广东化工;2006年10期
6 张静;荧光光谱法研究盐酸胍浓度不同时变性胰蛋白酶的构象变化[J];光谱学与光谱分析;2004年04期
7 郑婷;王卓渊;侯若冰;沈星灿;;圆二色光谱研究Ni~(2+)诱导血清白蛋白构象变化[J];广西师范大学学报(自然科学版);2008年03期
8 周文广,韦宇拓,黄鲲,陈发忠,黄日波;克雷伯氏菌甘油脱水酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达[J];工业微生物;2004年02期
9 徐卉芳,张先恩,张治平,张用梅,A.E.G.CASS;大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究[J];生物化学与生物物理进展;2003年01期
10 孟晓蕾;唐悦;齐向辉;韦宇拓;黄日波;;Lactobacillus diolivorans二醇脱水酶激活因子基因的克隆、测序与功能鉴定[J];生物化学与生物物理进展;2007年01期
中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 吕波;K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶高效催化特性的研究[D];石河子大学;2009年
2 张培源;单链抗体ScFv2F3的表达纯化及复性研究[D];吉林大学;2006年
3 张根林;K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶与复活因子的克隆表达及其复活关系研究[D];石河子大学;2007年
4 廖川;蛋白质吸附分子模拟中势能计算的优化算法[D];天津大学;2007年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王建平;柴立和;;蛋白质分子网络的分形结构[J];安徽农业科学;2007年06期
2 蔡渡江;王联结;;基于电子效应的氨基酸分类与二级结构的倾向性分析[J];安徽农业科学;2010年36期
3 付明哲;王联结;刘选治;;α-螺旋中2,3位氨基酸残基对螺旋结构稳定性的影响[J];安徽农业大学学报;2011年06期
4 任玲玲,何静,马润宇,段雪;固定化青霉素酰化酶的新载体[J];北京化工大学学报(自然科学版);2002年01期
5 宋建彬,张士茜,马润宇,任孝修;硅藻土强化吸附壳聚糖固定化青霉素酰化酶[J];北京化工大学学报(自然科学版);2004年05期
6 陈国;赵亚囡;姚善泾;方柏山;;固定化双菌串联发酵生产1,3-丙二醇[J];北京化工大学学报(自然科学版);2007年06期
7 林乐懿;张丽叶;末信一郎;郑海涛;白石智美;桶崎陽友;;His-tag标记的嗜热菌来源L-脯氨酸脱氢酶的纯化与性质[J];北京化工大学学报(自然科学版);2010年06期
8 姚鹏;张建军;王黎霞;安健;;低温诱导堆型艾美耳球虫3-1E基因的可溶性表达[J];北京农学院学报;2012年02期
9 裴智勇;任松叶;蔡禄;;基于二级结构预测蛋白质复合体亚基相互作用[J];内蒙古科技大学学报;2010年01期
10 王云峰,丁洁,卜定方,王芳;突变型COL4A5基因编码蛋白片段的表达及圆二色谱结构分析[J];北京大学学报(医学版);2004年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 秦培兰;米荣升;黄燕;周鹏;张国恩;苏庆美;呼高伟;曹薇;陈兆国;;微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60基因的融合表达及其抗血清的制备[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
2 郑艳;管艺飞;刘长江;;甘油脱水酶基因(gldABC)与1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的共表达[A];科学发展与社会责任(A卷)——第五届沈阳科学学术年会文集[C];2008年
3 庄绪静;曹雅忠;李克斌;尹姣;;同源建模和分子对接方法的应用与发展[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
4 高彩霞;王宗涛;冯恩民;修志龙;;间歇发酵过程的非线性动力系统辨识及最优控制[A];中国运筹学会第七届学术交流会论文集(下卷)[C];2004年
5 高彩霞;冯恩民;;一类以脉冲系统为约束最优控制问题的优化算法[A];中国运筹学会第八届学术交流会论文集[C];2006年
6 谢丹;蒋亚东;吴志明;李言荣;;牛血清清蛋白基生物分子LB膜的紫外光谱研究[A];第三届中国功能材料及其应用学术会议论文集[C];1998年
7 宿杰;王立群;何聚;余大书;;溶胶-凝胶法制备Ba_(1-x)La_xTiO_3陶瓷及其介电性能研究[A];2006年全国功能材料学术年会专辑[C];2006年
8 齐向辉;韦旭钦;杨登峰;吴杰群;孟晓蕾;唐悦;梁甜;杜丽琴;韦宇拓;黄日波;;一步法发酵葡萄糖生成1,3-丙二醇的基因工程菌的构建及分子改性[A];2005热带亚热带微生物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集[C];2005年
9 陈明胜;;蜂王幼虫活性肽保健功能的研究[A];2008年全国蜂产品市场信息交流会暨中国(郑州)蜂业博览会论文集[C];2008年
10 白雪峰;;PTT聚合单体——1,3-丙二醇的生产方法[A];中国化工学会2003年石油化工学术年会论文集[C];2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 曾凤辉;家蚕新基因BmEm4的克隆,表达与功能研究[D];浙江理工大学;2010年
2 张艳萍;蛋白质序列的数学描述及其应用[D];浙江理工大学;2010年
3 项宜娟;纤维床固定化酪丁酸梭菌产丁酸的研究[D];浙江理工大学;2010年
4 赵燕;家蚕HMGA蛋白的原核表达与功能研究[D];浙江理工大学;2010年
5 韩聪;家蚕OCIAD2基因的克隆表达及其定位研究[D];浙江理工大学;2010年
6 李春凤;家蚕Wibg基因的表达与定位分析功能的初步研究[D];浙江理工大学;2010年
7 张伟;分子光谱法研究蛋白质与小分子的相互作用及其分析方法研究[D];郑州大学;2010年
8 史舵;基于主成分分析方法的蛋白质亚细胞定位[D];大连理工大学;2010年
9 张作阳;基于鲁棒性分析推断三羟基丙醛对两种酶的抑制作用[D];大连理工大学;2010年
10 苏涛;甘油生物歧化生产1,3-丙二醇的混杂非线性动力系统辨识[D];大连理工大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 汤斌,张庆庆;红曲霉液体培养对产脂肪酶条件的研究[J];安徽机电学院学报(自然科学版);1997年04期
2 冷雪;陈劲春;董鹏;;重组人胰岛素及C肽的分离纯化[J];北京化工大学学报(自然科学版);2006年05期
3 刘森林,宗敏华,涂然,周番;水/有机溶剂双相中杏仁醇腈酶促不对称合成(R)-苯乙氰醇[J];催化学报;2001年01期
4 张伟 ,龚光甫 ,胡建国;混合醇对戊二醛鞣制的牛心包防钙化改性的实验研究[J];中国医师杂志;2002年07期
5 孙宏丹,孟秀香,贾莉,宋振岚;微生物脂肪酶及其相关研究进展[J];大连医科大学学报;2001年04期
6 沈星灿,梁宏,何锡文,王新省;圆二色光谱分析蛋白质构象的方法及研究进展[J];分析化学;2004年03期
7 陈珊,刘东波,夏红梅,何孟元,庄宇钢,董丽松;聚β-羟基丁酸酯解聚酶的纯化及性质[J];分子科学学报;2002年04期
8 冉华松;王崇辉;杨翔华;佟明友;;1,3-丙二醇的应用与市场[J];广东化工;2006年10期
9 魏晓芳,丁西明,刘会洲;pH诱导牛血清白蛋白芳香氨基酸残基微环境变化的光谱分析[J];光谱学与光谱分析;2000年04期
10 杜建红;药物发展中的外消旋体和对映体[J];国外医药.合成药.生化药.制剂分册;1994年04期
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 罗积杏;有机相酶催化非对称转酯化拆分α-氰基-3-苯氧基苄醇乙酯[D];浙江大学;2003年
2 肖庆敏;添加剂辅助变性碳酸脱水酶复性的研究[D];天津大学;2003年
3 张健;有机相酶催化不对称醇解反应拆分α-氰基苄醇乙酯及其反应动力学研究[D];浙江大学;2005年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王初升,尹卫平,林岳夫,陈荣忠,周秀兰,杨丰;泥蚶血液中δ-氨基乙酰丙酸脱水酶的测定[J];台湾海峡;1985年02期
2 范立强,袁勤生,吴祥甫;双质粒系统共表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB及其辅酶合成基因caiE[J];生物化学与生物物理学报;2002年01期
3 程佑发,浦铜良,张承烈,薛勇彪;沙芦茎高效表达的胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖脱水酶与水分胁迫相关[J];科学通报;2001年07期
4 孙博;刘志敏;游松;;1,3-丙二醇生产的研究进展[J];生物技术通讯;2008年05期
5 吕新芳!100050北京,吕京!100050北京,崔涛!100050北京,贺锡雯!100050北京;中国维吾尔族和彝族人群δ-氨基-γ-酮戊酸脱水酶基因多态性的分析[J];中华劳动卫生职业病杂志;2001年03期
6 于寒颖;杨谦;周东坡;金红星;;核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)arom基因3′-末端的克隆与分析[J];黑龙江大学自然科学学报;2005年05期
7 杨洁芳;梁华;樊建康;闭中强;;猕猴铅毒性诊断指标测定结果[J];实验动物与比较医学;1992年04期
8 项艳,范军,朱苏文,李纯,程备久;对生玉米5-氨基酮戊酸脱水酶的简单快速纯化[J];安徽大学学报(自然科学版);1999年02期
9 S·瓦特;李宏明;;在诱发昆虫产生抗药性的过程中起关键作用的酶[J];世界科技研究与发展;1990年05期
10 王玉萍,谭训刚,陈师勇,王勇,王静,李翔太;肉碱脱水酶突变株的获得及其休止细胞反应条件的优化[J];生物技术通讯;2000年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 杨仲丽;方柏山;李梓君;朱春杰;;丁酸梭菌中甘油脱水酶及其再激活酶基因的克隆表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
2 李雯君;方柏山;洪燕;王晓霞;林锦霞;刘桂兰;;甘油脱水酶再激活酶的克隆表达及活性鉴定[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
3 韦旭钦;陈发忠;韦宇拓;齐向辉;黄日波;;甘油脱水酶的定向进化及其高通量筛选方法[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
4 齐向辉;韦旭钦;杨登峰;吴杰群;孟晓蕾;唐悦;梁甜;杜丽琴;韦宇拓;黄日波;;一步法发酵葡萄糖生成1,3-丙二醇的基因工程菌的构建及分子改性[A];2005热带亚热带微生物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集[C];2005年
5 郑艳;管艺飞;刘长江;;甘油脱水酶基因(gldABC)与1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的共表达[A];科学发展与社会责任(A卷)——第五届沈阳科学学术年会文集[C];2008年
6 冯宝珍;李艳青;付丽;王会征;李培谦;王和美;王秀菊;张修国;;辣椒疫霉菌的几个重要功能基因的作用机制研究[A];2010年中国菌物学会学术年会论文摘要集[C];2010年
7 周瑞芳;吳國利;;小白鼠肝臟中蘇氨酸脫水酶誘導生成性質的研究[A];中国生理科学会学术会议论文摘要汇编(生物化学)[C];1964年
8 朱建国;李霜;纪晓俊;黄和;;1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)在Klebsiella pneumoniae中的表达研究[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
9 赵莉;王娅君;宫衡;马兴元;魏东芝;郑宇;徐佳杰;;克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇过程中关键酶及相关蛋白动态变化的研究[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
10 江剑辉;;高苯丙氨酸血症中的四氢生物蝶呤缺乏症和枫糖尿病的诊断、鉴别诊断和治疗[A];全国儿童营养及苯丙酮尿症研讨会论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐小琳;Klebsillae pneumoniae XJPD-Li重组甘油脱水酶特性及其复活动力学研究[D];天津大学;2010年
2 徐芳芳;柔性金属对大肠杆菌毒性机理的研究[D];东华大学;2012年
3 邱晓挺;突触结合蛋白C2结构域和甘露糖酸脱水酶的结构生物学研究[D];中国科学技术大学;2012年
4 傅维琦;产5-氨基乙酰丙酸重组菌的优化和发酵过程调控研究[D];浙江大学;2009年
5 马正;利用不同底物生产1,3-丙二醇及基因工程菌的构建[D];江南大学;2010年
6 周玉岩;吉他霉素生物合成基因簇克隆与基因工程菌株构建[D];甘肃农业大学;2012年
7 门丽娜;兴安落叶松不同生长时期诱导防御基因表达谱的变化[D];东北林业大学;2012年
8 王政逸;稻瘟病菌异柠檬酸裂解酶基因(ICL1)在致病过程中的作用[D];浙江大学;2002年
9 贺庆华;盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶同工酶基因的克隆、功能及产生机制研究[D];四川大学;2006年
10 陈献忠;产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因的克隆、表达与功能鉴定[D];江南大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 吕波;K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶高效催化特性的研究[D];石河子大学;2009年
2 杜好勉;利用甘油脱水酶基因构建产3-羟基丙醛工程菌及其表达比较[D];江南大学;2012年
3 涂志林;柔嫩艾美耳球虫β-羟酰-ACP:脱水酶生化特性及抑制动力学研究[D];南京农业大学;2009年
4 聂玲燕;克雷伯氏菌高产1,3-丙二醇菌株选育及关键酶基因转录调控研究[D];江南大学;2012年
5 庄文超;1,3-丙二醇合成途径中关键酶的研究[D];燕山大学;2011年
6 李天伯;黑暗链霉菌S.tenebrarius H6中与抗生素有关生物合成基因的克隆[D];沈阳药科大学;2001年
7 权国燕;3-羟基丙酸合成途径关键酶及再激活因子基因在大肠杆菌中的表达研究[D];江南大学;2011年
8 陈祥军;腺苷钴胺素合成酶基因cobs的克隆及在产1,3-丙二醇菌中的应用[D];江南大学;2010年
9 翟伟锋;辅酶B_(12)合成菌的筛选及相关合成基因的克隆表达和应用[D];江南大学;2011年
10 萨娜;3-羟基丙酸生物合成及辅因子代谢调控[D];北京化工大学;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026