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重组甘氨酸-胸腺素β4生产工艺研究

马素永  
【摘要】:心肌梗塞现已成为严重危害人类健康的疾病。目前临床上的治疗药物和方法很多,但还存在着相当大的问题,尤其是尚缺乏提高心肌耐缺血能力和促进心肌细胞修复的药物和方法。已有研究表明,胸腺素β4(简称Tβ4)有助于预防与修复缺血性心脏病发作后的心脏损伤,可用于心肌缺血性损伤的治疗。要将Tβ4成功开发成为治疗心肌梗塞的药物,制备工艺和质量标准的建立是至关重要的,本论文针对重组甘氨酸-胸腺素β4(简称Gly-Tβ4)的制备工艺、质量标准和药效学试验进行了研究。主要研究内容如下: 1.研究了摇瓶条件下工程菌的生长和诱导条件,得到了优化的摇瓶培养条件;研究了工程菌在30L发酵罐的生长和诱导条件,得到了优化的发酵条件,使目的融合蛋白得到了高效表达。 2.研究了重组Gly-Tβ4小试纯化工艺的建立,包括使用镍离子金属螯合层析纯化目的融合蛋白,凝胶过滤层析去除咪唑,使用凝血酶对目的融合蛋白进行酶切释放目的蛋白,阴离子交换层析对酶切后的目的蛋白进行初步纯化,反相层析对目的蛋白进行精纯化以及去除内毒素,阴离子交换层析对反相层析引入的有机溶剂进行去除并浓缩目的蛋白;小试纯化工艺方法初步建立后,又进行了工艺条件的优化,包括镍离子金属螯合层析上样液咪唑加入浓度的研究,凝血酶酶切条件的研究和反相层析洗脱条件的研究。经过多批纯化证明了小试纯化工艺的稳定性。 3.研究了重组Gly-Tβ4中试纯化工艺的建立,主要通过对小试纯化工艺的线性放大,基本按照层析柱直径增大、层析介质高不变、线性流速不变的原则进行放大,建立了中试纯化工艺,经过多批纯化证明了中试纯化工艺的稳定性。 4.研究了重组Gly-Tβ4质量标准的建立,重点研究并优化了使用反相高效液相色谱分析Gly-Tβ4纯度的方法,以及E-玫瑰花结法测定Gly-Tβ4生物学活性的方法,建立了完整的Gly-Tβ4原液和成品的质量标准。 5.进行了重组Gly-Tβ4的药效学研究,使用大鼠心肌梗塞模型进行了体内生物活性评价研究,结果表明,Gly-Tβ4对大鼠冠脉结扎造成的心肌梗塞有治疗效果。


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