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《天津大学》 2012年
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大肠杆菌合成左旋多巴及培养基优化

马强强  
【摘要】:帕金森病是一种锥体外系功能障碍引起的的慢性神经退行性疾病。患者大脑的黑质与纹状体的神经细胞受损,导致产生多巴胺的酪氨酸羟化酶下降,造成大脑中多巴胺生成不足。目前常用的临床治疗帕金森病有效药物是左旋多巴。本论文利用林可链霉素基因簇上的lmbB2基因构建生产多巴的工程菌,优化培养条件。并利用易错-PCR,试图提高lmbB2基因表达产物的活性。 本文构建了不同的重组质粒,挑选出pCDFDuet-1为lmbB2基因表达的最优表达载体,并对lmbB2基因的表达进行了优化,确定了在IPTG诱导浓度为1mmol/L,诱导时间为8h时,酶的表达水平最好。建立了高效液相色谱检测酪氨酸以及左旋多巴的条件,通过HPLC-MS检测到了发酵样品中确实有左旋多巴。 通过培养基的筛选,最终使用以甘油为碳源的M9培养基进行发酵。没有经过代谢改造的大肠杆菌中酪氨酸水平远不能满足lmbB2基因产物的羟化速度,添加底物能增加发酵液中多巴的水平。抗坏血酸的添加能够明显提高酪氨酸的转化率,当抗坏血酸的添加量3g/L,转化率最高可达到92.5%。Fe~(2+),H_2O_2的添加对于基因的表达是有利的。 利用易错-PCR,构建突变文库,并建立了快速筛选的方法。通过高产菌的测序以及生物信息学分析lmbB2基因产物的辅酶可能是血红素,催化活性位点可能是,96Gln,133Tyr,139Tyr,148Tyr,160His,170Asp,202His,238Tyr,239Asp,268Asp。 这本论文中所建立的工程菌表达效率高,遗传稳定,为进一步优化左旋多巴的发酵工艺以及lmbB2基因的活性位点的预测奠定了基础。
【学位授予单位】:天津大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:TQ463;TQ920.6

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【参考文献】
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